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Cell Rep.:纳米机器安慰下,心肌细胞线粒体分列可调治钙开释

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择要


       临床中,心力弱竭时期心律变态的产生是一个必要存眷的题目。地区电梯度引发心律变态,细胞离子跨膜梯度是其劈头。英国和意大利研讨职员Michele Miragoli等研讨了衰竭心脏心肌细胞的纳米级机器敏感特征能否与非常电运动的启动有关。经过纳米吸管发生液力放射,在肌膜特定地位构成凹痕,启动胞内钙开释。发明安康细胞中钙jinxian于部分地区,而衰竭心肌细胞中会传达分散。心力弱竭使膜渐渐变硬并使肌膜下线粒体位移。秋水仙素处置可经过硬化细胞、毁坏微管、挪动线粒体及引发钙开释来使安康细胞模仿衰竭。线粒体质子梯度的解偶联可消弭衰竭细胞和秋水仙素处置细胞中的钙启动。因而微管依赖的线粒体机器传感因子微区的毁坏,大概是心力弱竭时非常钙开释的一种机制。文章以“Microtubule-Dependent Mitochondria AlignmentRegulates Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in HeartMyocytes"为题宣布于Cell Reports


配景


       泵衰竭和心脏性猝去世是临床医治面对的紧张应战。心力弱竭时,机器敏理性的改动可引发电不波动和心律变态。利用原位完备心脏、离体心脏和离体细胞制剂,对促心律变态的机器电传导曾经有了普遍研讨,但信号传导及其启动所需的初始亚细胞机制仍不明白。已知肌节中,除产力之外另有些肌节卵白可提供机器传感和/或信号功效,这些肌节或Z盘复合卵白的渐变会招致细胞内Ca2+应对非常。


       心力弱竭时,细胞骨架重塑,大概会搅扰机器觉得的正常调控,而缺乏得当的机器反应控制大概会促进心力弱竭开展。心力弱竭时期产生的布局重塑触及细胞膜(T小管缺失)、闰盘以及膜下微域,如兰尼碱受体(RyRs)和肌质网。已知心肌堵塞晚期,胞外线粒体地位、纤维间线粒体分列产生改动,而线粒体及二分体的规矩分列在愉快-紧缩偶联和细胞内钙处置稳态中起着要害作用。关于线粒体重塑在机器电转导诱导的心律变态中的大概作用,ag真人理解甚少。因而很多传统技能无法选择性地机器激活或研讨单个肌膜微布局域内的线粒体到场状况。本研讨接纳扫描离子电导显微镜(SICM)和外表共焦SICM来办理细胞拓扑布局和线粒体定位题目。


        经过纳米精度的SICM纳米吸管施加压力,研讨心力弱竭机遇械诱导钙开释的亚细胞机制(图1)。安康心肌细胞中,以规矩的Z-grooves为目的的水力放射,可引发机器诱导的细胞内钙开释(MiCai)事情,且MiCai空间受限。在Z-grooves不规矩的衰竭心肌细胞中,MiCai则会传达至整个细胞。发生传达性MiCai的大概性与线粒体混乱水平,以及施力点膜适应性低落有关。扫除机器敏感离子通道和肌动卵白丝后,察看到可经过毁坏安康心肌细胞中卖力维持肌膜下线粒体地位的微管来模仿MiCai传达。线粒体质子梯度的解耦会消弭MiCai传达。好像与线粒体相干的微管大概代表一个信号微区,可对肌膜机器安慰做出反响。研讨标明在心力弱竭停顿历程中,微管和线粒体混乱在非常钙开释的启动中起着要害作用,为非举措电位介导的细胞内钙开释提供了一种表明机制。


后果

01-衰竭心肌细胞的布局与力学特征


       在心肌堵塞(MI)后差别工夫点,利用SICM扫描正常和衰竭心肌细胞(次要来自代偿性肥大,阔别瘢痕地区)的肌膜布局特性。依据拓扑图像,将移液管定位于肌膜上200nm处定(嵴或Z-groove或无布局地区)(图1A)。随后施加部分20kPa的水力放射2s。水力放射凹陷面积(图1B)在0.125 μm2范畴内。

图1 实行方案表示图。(A)5 μmol/L Fluo-4 AM处置细胞,SICM扫描细胞外表。纳米管置于嵴或groove上方,坚持200 nm间隔稳定,施加水射流压力。依据Clampfit 10.0 (Molecular Devices)设置收罗光闸(1-5KHz收罗共8s)和压力泵(20kPa继续2s)。记载Fluo-4荧光发射(颜色编码的延时图)、Z向压电位移(膜压痕)和机器诱导的钙肇始及传达。右为压力、Z向压电位移和钙瞬态读数间隔。(B)离体心肌细胞中,20 kPa水射流压力2s后的扰动地区。移液管添补1mM荧光黄,失掉约0.125μm2地区(绿点),插图为缩小。


       以大鼠为模子研讨心肌堵塞后开展为心力弱竭的心肌细胞,模子在16周呈现心力弱竭,有分明的肥厚及左心室衰竭。起首取得正常或衰竭心肌细胞10×10μm巨细的SICM拓扑图像,用于量化外表布局规矩性的毁坏状况,可见肌膜规矩性渐渐改动(图2A)。丈量心肌堵塞后16周的Z-groove指数,发明从比较心肌细胞的0.62±0.16明显低落到0.44±0.19(图2B)。因而心肌堵塞后,膜构造产生了本质性的改动,包罗嵴(crests)和沟(grooves)的消散。


       为研讨细胞外表微区的机器特征,在细胞平滑或沟区施加0-40kPa(通常20kPa)水力放射2s,记载移液管的垂直位移。移液管由SICM反应控制机制驱动,随细胞外表挪动,记载膜位移(Z向)与压力做函数。发明正常细胞中,沟四周地区比嵴处硬,施加相反压力移液器位移更少,但衰竭的细胞哪个地区的膜都比力硬(图2D)。


       心力弱竭开展时期,心肌堵塞后4周细胞外表纪律性开端产生变革,但不分明(图2A和2C)。肌膜的膜适应性明显增加(图2D)。8周时布局渐渐丢失,肌膜比比较细胞更硬。水力放射后的膜适应性数据盘算弹性杨氏模量,发明整个肌细胞外表的模质变化很大(图2D)。

图2 向心力弱竭开展时,MiCai传达从部分向全体变革。(A)左上为AMC心肌细胞外表;右上为心力弱竭细胞;左下为MI 8周的细胞;右下为MI 16周。(B)向心力弱竭开展时期MiCai传达频率。(C)Z-groove指数。(D)20kPa压力施加2s后的膜适应性。


02-衰竭心肌细胞中的MiCai


       安康的比较心肌细胞中,施加于Z-groove的压力启动结果部MiCai,特性是分散绝对迟缓,而且空间上范围于压力部位(图3A左)。而在衰竭心肌细胞中,MiCai始于压力部位并传达分散至整个细胞(图3A右)。衰竭细胞中MiCai传达更快(到达峰值的工夫更短),比较心肌细胞次要体现为部分MiCai,到达峰值总工夫为252.4±11ms,而衰竭心肌细胞次要为传达性MiCai,抵达峰值工夫为134±26ms(图3B)。研讨MiCai的特性和动力学发明,衰竭细胞中的MiCai事情的继续工夫比比较细胞长,且振幅更高(图3B)。随着心肌梗身后细胞重塑并向心力弱竭开展,MiCai传达的概率和频率增长。心肌堵塞后4周,传达性MiCai的呈现频率只是略高于比较,而心肌堵塞后8周,液力放射后传达呈现的频率更高(图2B)。


       通常衰竭的心肌细胞体现出两种差别的MiCai肇始和传达形式。一重是呈现一个伶仃的“波纹",从压力点下方开端并渐渐传达至整个细胞,产生在心肌堵塞后4、8和16周的一切工夫点。另一种更为庞大,MiCai波从压力点下方开端,但1或2ms后,会有一个或多个来自细胞核心的近程MiCai信号(二进制呈现)追随初始波。随后三重Ca2+波正面碰撞并疾速传达至整个细胞。


03-MiCai肇始与L型钙通道、肌浆网、拉伸激活通道或肌动卵白细胞骨架有关


       从0到低(0.1μmol/L)再到“心理程度"(1.8μmol/L)改动胞外Ca2+浓度,发明不会影响MiCai频率。nifedipine处置(克制钙内流)也未能制止MiCai产生(图3C左下)。Caffeine(RyR冲动剂)处置发明,只管高剂量Caffeine会使RyR2翻开,但不会改动正常和衰竭细胞中已传达MiCai的频率(图3C上)。其他大概触发MiCai的机器要素方面,液力放射会在细胞膜上构成凹痕并使膜产生拉伸,用100μmol/L streptomycin或30μmol/L钆(Gd3+)克制拉伸激活通道,未能消弭压力部位下的MiCai肇始,标明次要的部分机器传感因子与拉伸激活通道有关。鉴于肌节与骨骼肌间costamere处的很多卵白质是肌动卵白联合的机器传感卵白质,因而用5μmol/L细胞松懈素D处置2h,毁坏AMC细胞中的肌动卵白微丝,使心肌细胞肌膜变硬并阻断紧缩,但也没有改动MiCai事情的产生率或Z-groove比率。

图3 向心力弱竭开展时,MiCai传达从部分向全体变革。(A)AMC和MI后16周衰竭细胞的传达工夫图。(B)AMC和衰竭细胞中机器诱导的钙瞬变(MiCai)参数。(C)基线以及Caffeinenifedipine、CCCP和CsA存在下,AMC细胞中的MiCai频率。


04-心力弱竭时期线粒体的重排与触发MiCai相干


       细胞外钙到场的缺乏标明存在细胞内Ca2+源。已知线粒体到场压力诱导的细胞内Ca2+开释,因而接纳共聚焦显微镜联合SICM和透射电子显微镜(TEM),研讨衰竭细胞中二分体和线粒体之间的互相作用。在正常比较心肌细胞中,活泼的TMRM标志线粒体周期性分列与嵴对齐,反应出Z-grooves和T小管启齿分列规矩(图4)。心力弱竭细胞中线粒体得到构造纪律性,好像也变长(图4右),碎片变少,线粒体均匀面积增长。辨别用CCCP和环孢菌素A(CsA)克制线粒体质子梯度和通透性转换孔,发明消弭了衰竭细胞中传达的MiCai(图3C右下)。标明线粒体在该历程中起着正的作用。因而线粒体混乱与MiCai传达的产生相干,重塑线粒体微布局域在MiCai肇始中大概起正作用。

图4 MI引发的二元微区重构以线粒体位移为特性。左列:比较AMC;右列:心衰细胞(MI后16周)。从上至下顺次为:SICM外表拓扑图像;TMRM标志线粒体;SICM细胞拓扑和外表共聚焦交融图;心衰时线粒体重组的透射电子显微图。


05-微管网络混乱是线粒体位移的缘故原由


       有研讨发明微管到场MiCai和Ca2+i火花发生。用10μmol/L秋水仙素搅扰微管聚合(图5)。秋水仙素对外表Z-groove布局(Z-groove指数,处置前0.61±0.04,处置后0.63±0.05)或T小管密度都没有影响。但秋水仙素和诺考达唑处置都使T小管规矩性和膜适应性明显低落。秋水仙素处置后的细胞,液力放射对嵴施压,会使69%细胞引发MiCai,而比较AMC细胞(没有秋水仙素处置)中,这一比例为12%(图5A)。但是秋水仙素加CCCP(图5C)或秋水仙素加CsA组合处置都可以*消弭这种效应。共聚焦和TEM表现比较组中,秋水仙素使肌膜下线粒体产生了位移(图5B右),线粒体均匀面积增长,相似心力弱竭细胞。即便在正常细胞中,秋水仙素也会使膜变硬(图5D),并发生与心力弱竭时类似的膜适应性。标明微管网络的失调使线粒体产生挪动,这是MiCai易感的要害机制。


       已知β-tubulin在很大水平上与包罗线粒体在内的细胞质细胞器共定位。因而在秋水仙素处置的细胞中研讨线粒体移位及其重新定位与微管混乱之间的干系。免疫细胞化学剖析标明,秋水仙素明显毁坏了AMC细胞(图5B)和心力弱竭细胞中的心肌细胞β-tubulin。已知心力弱竭细胞中微管卵白网络非常,qPCR对mRNA表达剖析证明了α1A-tubulin(TUBA1A)、β2B-tubulin(TUB2B)、β3-tubulin(TUBB3)、γ-1 tubulin(TUBG1)和tubulin相干卵白(MAP4)的表达总体增长。以上这些均与微管动力学的改动有关。*毁坏衰竭心肌细胞的微管网络(秋水仙素处置)并没有消弭MiCai,也不会明显影响膜适应性。

图5 毁坏微管会招致MiCai产生频率更高。(A)MiCai工夫历程图。上,20kPa没有发生MiCai;下,10μmol/L秋水仙素36℃孵育1h,20kPa体现出MiCai传达。(B)T小管(绿色)和β-tubulin(白色)染色。最右电子显微镜图片为10μmol/L秋水仙素孵育1h后AMC细胞中染色体挪动。(C)差别处置下的MiCai传达频率。(D)秋水仙素和CCCP处置的AMC中嵴和沟处的膜适应性。


06-人衰竭DCM细胞中的MiCai

      

       使用扩张型心肌病(DCM)患者的心肌细胞研讨民气肌细胞的MiCai产生率。SICM成像展现了拓扑异质性(图6A),与之前察看到的衰竭大鼠心肌细胞相似。施加压力后65%产生MiCai传达(图6B和6C),次要为压力施加在非横纹、较硬的地区时(图6D),可模仿大鼠心力弱竭模子。与大鼠衰竭细胞相似,人DCM细胞中α1C-tubulin(TUBA1C)、β2A-tubulin(TUBB2A)、TUBB3TUBG1MAP4较非衰竭心肌细胞明显上调,标明微管瓦解在细胞MiCai易感中起次要作用(图6E)。

图6 人DCM心肌细胞中MiCai的呈现状况。(A)民气衰心肌细胞的膜。(B)MiCai传达工夫图。(C)荧光示踪MiCai。(D)民气衰细胞中传达MiCai的频率。(E)与非心衰心肌细胞相比,DCM心肌细胞中微管卵白mRAN上调。


结论

    

       本研讨联合SICM,刻画了单个细胞中机器引发的脉冲传达,可以以纳米精度辨认并定位活细胞(分外是心肌细胞)中的功效性机器感到。失掉的数据标明,衰竭会改动肌膜拓扑布局和机器特征,毁坏膜布局纪律性、使适应性低落(变硬)。由心力弱竭衍生的心肌细胞中,由于细胞膜硬度较高、微管网络非常,会将部分纳米机器应力发生的部分性、线粒体依赖性的Ca2+开释变化为传达性Ca2+开释,从而启动细胞范畴内的Ca2+波传达。别的微管网络毁坏是MiCai传达的先决条件,线粒体重排也与触发MiCai有关,而LTCC和肌质网等钙源与MiCai的发生有关。鉴于多细胞程度下的胞内Ca2+波可促进心律变态的产生,本文形貌的机制大概表明了局部异位肇始和传达引发心律变态的机制。不但从机器方面加深了了解,也为临床提供了新的医治靶点。别的,膜适应性的改动大概成为一个潜伏的临床标记,经过改动力的通报从而改动钙含量。


参考文献:

Miragoli,  M. , et al. "Microtubule-Dependent Mitochondria Alignment Regulates  Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in Heart  Myocytes." Cell Reports 14.1(2016):140-151.

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