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具有可调应力松懈的水凝胶可调控干细胞的运气及活性

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       自然细胞外基质(ECM)是粘弹性的并体现出应力松懈,而用于分解3D培育所需ECMs的水凝胶通常是弹性的。美国研讨职员Ovijit Chaudhuri等经过质料学办法,独立于水凝胶的初始弹性模量、降解和细胞粘附配体密度,独自调治了3D培育所用水凝胶的应力松懈速率。发明培育于较快松懈速率水凝胶中的细胞铺展、增殖和间充质干细胞(MSCs)成骨分解均失掉加强。此中在初始弹性模量17kPa的疾速松懈水凝胶中,MSC会构成相似于骨的矿化、富含胶原卵白1的基质。别的研讨还发明应力松懈的作用由粘附配体联合、actomyosin紧缩性和粘附配体的机器收集介导。研讨效果夸大了应力松懈的紧张性,它是细胞-胞外基质互相作用的一个要害特性,也是细胞培育生物质料的一个紧张设计参数。文章以“Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate andactivity"为题宣布于Nature Materials


配景


       由聚乙二醇(PEG)、藻酸盐和通明质酸等聚合物的交联网络组成的水凝胶,常经过共价偶联到整合素联合配体(如RGD)用于3D细胞培育,或作为装载细胞的生物质料埋植剂来促进构造再生。相较于胶原、纤维卵白等,这些水凝胶可完成独立控制理化性子(如基质弹性、配体密度、孔隙度),以及在微标准上的匀称性,因而常作为利用shouxuan。但是除非水凝胶可随工夫降解,不然包罗外形变革、迁徙和增殖在内的一些正常细胞历程,在这些水凝胶中会遭到克制。固然不行降解水凝胶可捕获心理性ECM的一些特性,但通常简直是*弹性的。相比之下重构的细胞外基质(如胶原或纤维卵白)和种种构造(如大脑、肝脏、脂肪构造、凝结的骨髓、初期骨折血肿或再生骨的软骨痂)都是粘弹性的,而且在施加15%的恒定应变时体现出局部应力松懈(图1a)。细胞在2D培育中一样平常产3-4%的应力,在3D培育中发生20-30%的应力。别的应力松懈实验中测得的峰值应力范畴为100-1000 Pa,*在3D培育中细胞发生的应力范畴内。已知质料的机器特征可以调治粘附细胞的举动,基质贮存(纯弹性)或散失(粘弹性)细胞力的才能激烈表示细胞与之有互相作用。有研讨发明,在利用水凝胶作为细胞培育基质的状况下,改动基质粘弹性(与基质硬度有关)会对种种细胞举动发生影响。在体现出应力松懈的凝胶中,细胞随工夫施加到基质上的每一个力或应变最后都遭到肯定的硬度抵挡,该硬度由初始弹性模量界说,随后随着工夫的推移阻力减小。关于由弱交联构成的水凝胶,松懈局部源于交联的解联合及水凝胶活动,因而细胞力可以机器地重塑基质。本文研讨了水凝胶粘弹性和应力松懈对3D培育中细胞铺展、增殖和MSC分解的影响。


后果

01-具有可调应力松懈的水凝胶


       选择多糖藻酸盐(alginate)举行水凝胶纳米级布局调解研讨,以开辟一组应力松懈速率普遍但具有类似初始弹性模量的质料。固然改动交联化学物质或聚合物浓度也可以改动水凝胶的应力松懈特征,但研讨职员开辟了一种质料学办法,可控制具有单一交联剂范例和相反藻酸盐浓度的水凝胶的应力松懈速率。假定经过利用差别分子量的聚合物与差别交联密度的钙(与藻酸盐离子交联)联合,由于网络中毗连性和链挪动性的改动,可以调治所得水凝胶的应力松懈性子(图1b)。由聚合物分子量低落惹起的初始弹性模量的任何相干低落都可以经过增长交联来赔偿。别的,假定短PEG spacer与藻酸盐的共价偶联将为藻酸盐链的交联提供空间位阻,并加强凝胶中的应力松懈(图1b)。这两种办法都市改动单个聚合物链之间的净亲和力,从而无望控制松懈举动。因而研讨职员经过将藻酸盐的分子量从280 kDa低落到35 kDa,而且进一步将5 kDa的PEG spacer偶联到35 kDa藻酸盐,证明应力松懈的速率明显进步(图1c)。详细而言,将质料的初始应力松懈至其一半的工夫(τ1/2)从约1h调解至约1min,同时藻酸盐聚合物浓度和初始凝胶弹性模量坚持恒定(图1c-e)。这些工夫范畴与种种构造中丈量的范畴相似(图1a),且可与细胞举动工夫相干联。这些质料的应力松懈举动遵照双元素Maxwell-Weichert线性粘弹性模子。丈量凝胶的频率相干流变特征,发明随着频率低落,剪切储能模量的低落速率更大,应力松懈速率的增长与之相干。共聚焦荧灯光显示微镜证明凝胶在微米标准上是匀称的。别的在构造培育条件下,这些凝胶的机器功能和凝胶的干聚合物质量在至多7天内都是波动的(图1f,g)。因而在这个工夫标准上,基质的降解可以疏忽不计。综上所述,该办法可以独自控制基质应力松懈的,与初始弹性模量和聚合物浓度有关,而且没有水凝胶降解。

图1 调解藻酸盐水凝胶的纳米级布局,以独立于初始弹性模量和基质降解调治应力松懈特征,从而取得粘弹性举动。(a)交联水凝胶(聚丙烯酰胺)、胶原凝胶、骨折血肿(人)和种种构造(大鼠)的应力松懈实验。(b)低落钙(白色)交联的藻酸盐聚合物(蓝色)的分子量怎样低落网络的胶葛与毗连性(橙色箭头),以及小spacer的耦合怎样提供交联区的空间距离。(c)差别分子量藻酸盐或与PEG spacer偶联的低分子量藻酸盐构成的凝胶的应力松懈实验。(d)c中的τ1/2。应力松懈的工夫随布局的改动而明显低落。(e)c中凝胶的初始模量丈量。弹性模量间的差别不明显。(f)培育1天或7天后藻酸盐水凝胶的初始弹性模量。(g)培育1天或7天后藻酸盐水凝胶的干质量。


02-应力松懈影响细胞铺展和增殖


       用以上研讨了3D培育中基质应力松懈速率对细胞铺展和增殖的影响。3T3成纤维细胞封装于RGD偶联的藻酸盐水凝胶中,水凝胶具有差别的应力松懈速率,但初始弹性模量均约9 kPa(图2a)。在应力松懈工夫较长(τ1/2约1h)的质料中,细胞铺展和增殖都遭到克制,且察看到不行降解弹性水凝胶中典范的圆形细胞形状。随着应力松懈加速,细胞铺展和增殖都随之增长(图2b,c)。当RGD细胞粘附配体密度在松懈较快的凝胶中增长时,基质应力松懈对细胞铺展和增殖的影响加强,标明应力松懈的作用是经过基于整合素的粘附介导的(图2d)。由于初始弹性模量和藻酸盐浓度恒定,而且RGD细胞粘附配体密度也坚持恒定在0、150或1,500 μm,因而细胞铺展和增殖的加强仅归因于应力松懈的改动。在疾速松懈水凝胶中察看到细胞外形的明显变革标明,细胞对水凝胶举行了机器重塑,由于水凝胶孔为纳米级且不行降解,因而细胞外形的变革和增殖必需经过基质挪动来完成。

图2 凝胶包裹的成纤维细胞中,铺展和增殖随着应力松懈的加速而进步。(a)包裹在藻酸盐凝胶中的3T3细胞。绿色为actin,蓝色为细胞核。于培育7天后拍摄。(b)包括单个3T3细胞的最小界限框的最长尺寸的量化。细胞铺展随应力松懈加速而明显增长。(c)增殖细胞定量。增殖随应力松懈加速而增长。(d)在松懈工夫为70或170s的藻酸盐凝胶中,量化包括单个3T3细胞的最小界限框的最长尺寸,作为RGD密度的函数。细胞铺展随两种凝胶中RGD浓度增长而明显增长。


03-基质应力松懈调治MSC分解


       接上去察看基质应力松懈对3D培育中小鼠间充质干细胞系(D1, MSC)分解的影响。已知封装在离子交联藻酸盐水凝胶中的D1 MSC和原代人MSC,在1-10 kPa初始模量下次要向成脂分解,在11-30 kPa初始模量下次要向成骨分解。假定在初始弹性模量为11-30 kPa的基质中,MSC的成骨分解将随着凝胶中松懈的加速而增加。为了测试能否是这种状况,将MSC封装在具有差别应力松懈工夫和初始弹性模量的藻酸盐水凝胶中(图3a、b)。当基质的初始弹性模量为约9 kPa时,MSC次要体现出成脂分解(中性脂质染色),以及十分低程度的成骨分解(ALP染色和ALP活性定量剖析),一切应力松懈工夫都是云云(图3a,b),而在松懈工夫约1min的疾速松懈凝胶中,发明脂肪天生程度低落。相反,在约17 kPa的较高初始弹性模量时,没有察看到成脂分解,而且在应力松懈较快的凝胶中成骨分解明显加强(图3a,b)。好像细胞只是复杂地随着工夫的推移整合基质的弹性模量,随着应力松懈更快,成骨增加,成脂增长。更快的应力松懈也促进了MSC更大水平的铺展。只管细胞初始接种密度坚持稳定,但7天后较硬凝胶中的细胞密度好像更高,这大概是由于成脂细胞和成骨分解细胞之间的增殖差别。别的在弹性模量9 kPa(成脂)和17 kPa(成骨)的迟缓松懈凝胶(如τ1/2为2,300s)中,MSC间的细胞形状类似;在应力松懈工夫2,300s和300s,17 kPa水凝胶中(成骨明显增长),MSC的细胞形状也类似(图3)。因而MSC的运气与细胞的外形是分散的,这与曩昔关于MSC在3D培育中分解的发明分歧。

 

       除表征MSC的分解,还检测了成骨分解干细胞的功效活性。已知在迟缓松懈的藻酸盐凝胶、PEG凝胶、可降解的通明质酸凝胶,或触变性PEG硅胶的3D基质中,MSC向成骨分解。但是尚无研讨发明这些分解的细胞构成互相毗连的、矿化的和富含Ⅰ型胶原的基质(骨的三个要害布局特性)。本研讨使用Von Kossa染色、免疫组化和能量色散x光光谱(EDS)表现,应力松懈较快条件下培育14天后,基质矿化和Ⅰ型胶原堆积都失掉加强(图3c、d)。在应力松懈工夫约1min的疾速松懈凝胶中,MSC构成互相毗连的骨样基质,该应力松懈工夫靠近晚期骨折血肿的工夫(图1a)。这一后果标明,疾速松懈凝胶不但能促进zuida限制的成骨,还能使成骨分解的干细胞具有成骨活性。

图3 MSCs向成骨分解并仅在疾速松懈凝胶中构成互相毗连的富含矿化Ⅰ型胶原的基质。(a)油红O(ORO)染色冷冻切片,(白色)表现成脂分解,ALP染色(蓝色)表现晚期成骨分解。(b)ORO染色阳性细胞百分比定量,细胞裂解物中ALP活性定量。随着应力松懈的加速,成骨分解明显增长。(c)培育2周后凝胶冷冻切片上Von Kossa(矿化)和Ⅰ型胶原染色。(d)培育2周后,凝胶切片的扫描电子显微和SEM-EDS图像。磷元素图(白色)掩盖在响应的反向散射SEM图像上。


       在发明初始弹性模量和应力松懈率对MSC分解和骨构成活性的激烈影响后,研讨了疾速应力松懈促进这些举动的潜伏机制。鉴于细胞经过与胞外基质配体的联合来感知胞外基质中的机器信号,因而起首反省了RGD密度对MSC分解的影响(图4a)。在150 μm的较低RGD密度下,在初始弹性模量17 kPa的水凝胶中察看到应力松懈更快,成骨加强趋向更强,但成骨分解的水平绝对于较高RGD密度明显低落(图4a)。标明应力松懈对成骨分解的影响是经过胞外基质配体介导的。细胞经过整合素受体与细胞外基质配体联合。利用辨认抗体表现在松懈更快的凝胶中,β1整联卵白向细胞外周的定位增长(图4b)。但没有察看到桩卵白paxillin在细胞四周的定位,这标明在这种3D质料体系中,任何应力松懈程度下都没无形成惯例的部分粘连。已知配体收集与成骨分解相干,利用基于荧光共振能量转移(FRET)的技能评价RGD配体收集。在包裹了细胞的快和慢松懈凝胶中,共聚焦显微镜剖析偶联到藻酸盐上的荧光素-RGD和TAMRA-RGD间的FRET(图4c,d)。在培育18h后,松懈较快凝胶中与MSC相邻的水凝胶地区检测到的能量转移,相较松懈较慢凝胶水平更高(图4e)。在疾速松懈凝胶中,细胞四周整个地区的FRET一样平常都是加强的。由于FRET信号可敏捷反响供体和受体荧光团之间的间隔,证明白RGD配体的收集,以及在松懈更快、初始弹性模量17kPa的水凝胶中,细胞对水凝胶的部分机器重塑。只管在松懈更快、初始弹性模量9kPa的凝胶中,察看到相似的RGD配体收集增趋向,但转移水平明显低于更硬的疾速松懈凝胶。


       由于整合素的联合和收集激活了信号通路,研讨职员探求了差别应力松懈程度的凝胶中,信号通路在介导成骨中的作用。已知细胞经过肌动球卵白紧缩(通常激活Rho信号通路介导)感知胞外基质的硬度,并经过激活Rac信号通路感知2D丙烯酰胺基质的丧失模量。对包裹于初始弹性模量17kPa水凝胶中的MSC,经过药理学克制myosin、Rho和Rac1。ML-7对myosin轻链激酶的克制使成骨作用增加,标明疾速应力松懈基质中成骨作用的加强触及myosin的紧缩性(图4f)。Y-27632克制Rho会促进成骨(图4g)。用NSC 23766克制Rac1对成骨没有明显影响(图4h)。

图4 较硬水凝胶中,经过ECM配体密度、RGD配体收集增长、myosin紧缩性介导的MSC成骨分解。(a)包裹于水凝胶的MSC中ALP活性定量。(b)培育一周的MSC中,actin(绿色)、细胞核(蓝色)和β1整合素(白色)的免疫荧光染色。(c)RGD-荧光与RGD-罗丹明间的FRET剖析。(d)培育18h后,差别应力松懈特征水凝胶中,MSCs四周水凝胶中的FRET受体信号(白色)和细胞核(DAPI/蓝色)的共焦显微镜图像。空缺点表现细胞的地位。(e)细胞界限2-3μm范畴内,定量FRET受体信号的加强。(f)ML-7(myosin轻链激酶克制剂)存在时MSC的ALP活性。(g)Y-27632(Rho激酶克制剂)存在下,MSC的ALP活性。(h)NSC 23766(Rac1克制剂)存在下,MSC的ALP活性。


       接上去反省了YAP转录调治因子的审定位。YAP转录调治因子被以为是细胞机器或多少应对中,控制细胞基因表达的要害调治元件。已知2D丙烯酰胺基质上培育的MSC在基质硬度改动时,YAP的审定位可引导MSC分解为成脂或成骨细胞。研讨发明随着应力松懈更快,YAP的核易位增长,标明基质应力松懈对转录因子活性有影响。差别弹性模量间核YAP的程度变革的范畴相反(图5a,b)。由于成脂分解次要在弹性模量约9kPa的基质中察看到,成骨分解次要在弹性模量约17kPa的基质中察看到,证明YAP的核易位与MSC运气有关(图5c,d)。标明在3D培育的MSC中,YAP的定位自己并不克不及控制细胞分解。

图5 YAP审定位可经过较快的应力松懈失掉加强,但与MSC运气有关。(a)培育一周的MSC中,免疫荧光染色actin(绿色)、细胞核(蓝色)和YAP(白色)。(b)核YAP与细胞骨架YAP浓度的定量比率。核YAP随着更快的应力松懈而明显增长。(c)量化ORO染色阳性的D1细胞百分比,作为绝对核YAP的函数。(d)量化分解的D1细胞中ALP,作为绝对核YAP的函数。


结论

       本研讨展示了一种调治藻酸盐水凝胶应力松懈性子的办法,并指出基质应力松懈对细胞生物学有深入影响。夸大了将基质应力松懈视为了解细胞-胞外基质互相作用、机器转导底子生物物理学的根本信号黑白常紧张的,由于大少数心理性的细胞外基质都体现出肯定水平的应力松懈。在构造工程使用中,应力松懈可作为一个质料设计参数,分外是调治细胞增殖和促进骨再生方面。


参考文献

Chaudhuri,  O. , et al. "Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem  cell fate and activity." Nature Materials 15.3(2016):326-334.

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