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养分不良的心肌细胞中,构造硬度增长会触发紧缩功效停滞和端粒延长

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       杜氏肌养分不良(DMD)是一种稀有的X连锁隐性疾病,与严峻的举行性肌肉退步有关,终极因心肺衰竭而殒命。有研讨在DMD小鼠模子的心肌细胞中察看到了增殖非依赖性端粒延长。Alex C.Y. Chang等利用人诱导多无能细胞分解的心肌细胞(hiPSC-CMs),联合HCells高通量单细胞功效检测体系,发明DMD hiPSC-CMs在纤维化样生物工程水凝胶上表现着力发生缺陷、钙处置非常以及活性氧程度增长。别的还察看到DMD hiPSC-CMs有丝破裂后端粒的渐渐延长与shelterin复合物、端粒帽卵白的下谐和p53 DNA毁伤应对的激活同时产生。这种端粒延长可被克制DMD心肌细胞紧缩的(布雷他汀)blebbistatin阻断。研讨夸大了纤维化硬化在DMD心肌病病因中的作用,失掉数据标明端粒延长是渐进的、紧缩依赖的,而且机器力敏感,为医治干涉提供了看法。文章以“Increased tissue stiffness triggers contractile dysfunction and telomere shorteningin dystrophic cardiomyocytes"为题宣布于Stem Cell Reports


配景

      

       杜氏肌养分不良症(DMD)是由编码dystrophin(一种毗连细胞骨架和细胞外基质的卵白)的基因中,> 200个渐变惹起的,发病率为1:5,000,DMD患者体现出晚期和举行性骨骼肌退步和有力,通常在30岁之前去世于扩张型心肌病和呼吸衰竭。DMD在心脏中的体现为心电图非常、紧缩和舒张功效停滞、纤维化,终极招致心力弱竭。AAV介导的基因医治和基因编辑战略在植物模子中表现出宏大远景。但由于缺乏对心力弱竭机制的了解,DMD患者承受的照旧非特异性心力弱竭医治,如β受体停滞剂或ACE克制剂。

  

       曩昔发明dystrophin缺乏与较短的端粒有关,端粒是六核苷酸TTAGGG反复序列,掩盖并掩护染色体末了。经过用mdx4cv和TERC敲除(mTR)小鼠繁育出的mdx4cv/mTRG2小鼠可照实再现扩张型心肌病表型。定量荧光原位杂交(Q-FISH)测得mdx4cv/mTRG2小鼠和DMD患者心脏构造中,心肌细胞的端粒与mdx4cv/mTRHet小鼠比较或同龄人比较的端粒相比,信号增加了约50%。但这种与增殖有关的端粒延长的触发机制仍旧未知。


       为深化理解端粒延长的分子和细胞病因,研讨职员利用由患者分解来的心肌细胞和同基因比较人类诱导多无能细胞(hiPSC-CMs),构建了培育条件下的人DMD心肌病模子,并绘制疾病停顿图,这是一种用于研讨心脏缺陷的壮大体系。紧张的是,创建了一个生物工程平台,容许心肌细胞以1:7的纵横比定向生长并模仿DMD纤维化心脏的硬度。发明DMD hiPSC-CMs体现出非常的钙处置、紧缩缺陷和与增殖有关的端粒延长。这种端粒延长产生于有丝破裂后,是举行性的,且受紧缩影响。经过在模仿安康和纤维化心肌硬度的生物工程平台上培育hiPSC-CMs,发明DMD心脏的心肌硬度特性会加剧紧缩功效停滞。


后果

01-杜氏hiPSC-CMs可再现扩张型心肌病的致病特性


       为研讨DMD hiPSC-CMs端粒延长的分子底子,将6个DMD和6个比较hiPSC-CMs细胞系分解为跳动的心肌细胞。利用了来自四个差别实行室的泉源于差别细胞范例的hiPSC细胞系,包罗两个经过CRISPR-Cas9(Con1和2对应DMD1和2)改正dystrophin渐变的同基因对,一个经过CRISPR-Cas9(Con3对应DMD3)将前六个外显子的缺失引入安康细胞的同基因对,三个非家属安康比较(Con 4,5和6),和三个DMD细胞系(DMD4,5和6)。免疫荧光染色测定hiPSC的多能性标志物OCT4、NANOG和SOX2(图1B),跳动的心肌细胞确定表达标记卵白、心肌肌钙卵白(c替恩替)和α-actinin(图1C)。免疫荧光(图1D)和qRT-OCR(图1E)确定dystrophin的存在与否。



图1 DMD hiPSC-CMs的发生。(A)hiPSC分解发生hiPSC-CMs的步调。(B)多无能细胞标记物染色OCT4、NANOG、SOX2。(C)心脏troponin T、α-actinin、DAPI染色。(D)安康和和DMD hiPSC-CMs的dystrophin、心脏troponin T、DAPI染色。(E)hiPSC-CMs中内源性dystrophin和utrophin (UTR)表达程度。


       1 Hz起搏条件下用Fura2丈量以评价底子钙程度。察看到静息钙比率变革增长(图2A)、峰值钙比率降落趋向(图2B)、瞬时振幅降落(图2C)、除Con2/DMD2外抵达峰值的工夫无差别(图2D)、90%钙瞬变继续工夫(图2E)、衰减τ增长(图2F)。与之前利用Fluo-4办法察看到的自觉钙瞬变趋向相似。与比较组相比,DMD hiPSC-CMs体现出钙瞬变非常,除Con2/DMD2外瞬变幅度低落、抵达峰值的工夫耽误、TD50延伸,但衰减τ没有差别,与先前在DMD和其他遗传性扩张型心肌病hiPSC-CMs中表征的钙瞬变相似。总之,利用两种差别的钙瞬酿成像办法证明了DMD hiPSC-CMs钙处置非常。



图2 DMD hiPSC-CMs体现出钙处置非常。(A)静息,(B)峰值,(C)瞬移幅度,(D)抵达峰值的工夫,(E)90%钙瞬变继续工夫,(F)衰减τ。


02-当遭到增长的机器负荷时,DMD hiPSC-CMs体现出紧缩力发生停滞


       为丈量DMD hiPSC-CMs的紧缩力,开辟了一个牵引力显微镜平台,利用可调水凝胶模仿纤维化产生前(10kPa)和后(35kPa)的心脏构造硬度(图3A)。经过微图案化将单个hiPSC-CMs构建为7:1长宽比,这是成体心肌细胞的特性,可促进HiPSC-CMs肌节分列和成熟。牵引力显微镜平台捕获单个心肌细胞发生的力,作为水凝胶变形的函数,经过跟踪嵌入的荧光微珠(图3B),利用傅立叶变更牵引细胞术重修牵引应力。丈量DMD和10和35kPa水凝胶安装上培育的安康hiPSC-CMs中,几个紧缩周期中的紧缩参数,包罗力和速率(图3C。


       35kPa条件下,与比较组相比,DMD hiPSC-CMs中力的发生明显增加,但10kPa水凝胶中没有(图3D)。35kPa水凝胶上的DMD hiPSC-CMs还表现紧缩速率(图3E)、舒张速率(图3F)和细胞外表积(图3G)低落,与钙处置方面的丈量后果分歧。仅在35kPa基质上培育的DMD hiPSC-CMs中呈现紧缩缺陷,这一现实标明一旦心脏构造履历纤维化硬化(DMD心肌病的一个标记),DMD心肌细胞就无法赔偿dystrophin缺陷。


       实行测得底子条件下,DMD hiPSC-CMs的活性氧(ROS)增长,但线粒体呼吸没有差别。已知心肌细胞在心力弱竭条件下会变化为糖酵解代谢。实行发明在养分缺乏条件下,如仅含葡萄糖、仅含丙酮酸盐或仅含棕榈酸盐,DMD hiPSC-CMs底子耗氧率和zuida耗氧率明显低落。标明DMD hiPSC-CMs体现出代谢顺应不良和紧缩功效停滞,与DMD心力弱竭停顿中的察看后果相似。



图3 纤维化微情况处置下DMD hiPSC-CMs体现出紧缩功效停滞。(A)牵引力显微镜评价DMD hiPSC-CMs紧缩。(B)10或35kPa水凝胶上单个hiPSC-CMs发生的紧缩力。(C)紧缩周期。(D)力,(E)紧缩速率,(F)舒张速率和(G)细胞面积。


03-没有细胞破裂状况下的端粒延长

      

       探求了DMD hiPSC-CMs能否会体现出端粒延长,与人DMD心脏构造心肌细胞和mdx4cv/mTRG2心脏构造相似。利用Q-FISH丈量了一段工夫内增殖性hiPSCs和分解的hiPSC-CMs的端粒信号(图4A和4B)。增值性hiPSCs的端粒信号与安康比较和DMD hiPSCs,或三个等基因对间无统计学差别(图4C)。


       陪同着朽迈历程中每个细胞破裂的不*复制,端粒丧失通常是一个“主动"历程。经过hiPSC-CM平台可以测试心肌细胞在没有DNA复制和细胞破裂的状况下能否也会产生端粒延长。已知小鼠和人出生后发育时期,心肌细胞大多处于有丝破裂前期。经过EdU掺入法测定端粒长度及DNA复制,评价了hiPSC-CMs分解的一段工夫,此中第0天被界说为分解的diyi天(图4D、4E)。发明与DMD小鼠(mdx4cv/mTRG2)和DMD患者后果分歧,DMD hiPSC-CMs端粒较比较组渐渐延长,在第30天端粒增加了50%(图4D)。EdU标签表现,在第16天仍产生增殖,但在第20天至第30天之间增殖中止(图4E)。正是在有丝破裂后的这段工夫里,察看到DMD hiPSC-CMs端粒与比较组相比产生举行性增加,终极在第30天增加了约50%(图4D)。



图4 DMD hiPSC-CMs体现出端粒延长和DNA毁伤应对。(A)Q-FISH量化端粒长度(TelC)。(B)心脏troponin T、TelC、DAPI染色的hiPSC-CMs。(C)Q-FISH量化hiPSC端粒。(D)第20-30天间DMD hiPSC-CMs渐渐呈现端粒丧失。(E)第20-30天hiPSC-CMs缺乏EdU。


       假定端粒延长的晚期分子触发要素大概是端粒得到掩盖的外壳卵白。研讨职员分散了第20天,即非增殖呈现端粒延长时的心肌细胞,TMRM染色评价线粒体膜电位,流式细胞仪富集hiPSC-CMs。qRT-PCR表现与比较hiPSC-CMs相比,端粒延长DMD中端粒反复联合卵白(TRF1和TRF2)和shelterin复合卵白(RAP1、TIN2和POT1)的转录程度低落。为确定端粒延长能否激活了DNA毁伤应对,评价了p53程度(图5A)、每个单细胞p53联合卵白1(53BP1)foci数(图5B和5D)和p21程度(图5C和5E)。发明DMD hiPSC-CMs中p53卵白上调(图5A),比较组和DMD组中53BP1阳性hiPSCCMs的产生率从10%增长到50%(图5)。别的,53BP1的积聚与p53卑鄙靶向p21卵白的表达相干(图5C和5E)。如53BP1降低所示,DNA毁伤应对的激活诱导p53介导的PGC-1a克制,这反过去拦阻线粒体生物产生(图5F-5H)。别的与安康比较组相比,DMD hiPSC-CMs中凋亡标志物caspase-3和cleaved PARP增长,β-半乳糖苷酶信号积聚增长。当从第20天开端天天利用布雷他汀(blebbistatin)阻断DMD hiPSC-CM紧缩,经过控制剂量将肌球卵白头部锁定在低亲和力形态,从而避免actin联合,发明端粒延长停止了,第30天丈量确定的确云云(图5I)。标明shelterin基因下调陪同着由于非常紧缩招致的非细胞破裂的端粒延长,惹起p53依赖的DNA毁伤应对。



图5 DMD hiPSC-CMs中p53上调。(A)p53激活的western图像。(B)DNA毁伤53BP1 foci的免疫荧光图像。(C)心脏troponin T阳性hiPSC-CMs中的p21。(D, E)p21定量。(F)qRT-PCR测得PGC-1α(线粒体生物产生的次要调治因子)表达增加。(G)MitoTracker Green和qRT-PCR测得的线粒体数目。(H)线粒体拷贝数目。(I)第20-30天利用布雷他汀克制DMD hiPSC-CMs紧缩时,可制止端粒丧失。


结论


       本研讨证明白在含布局卵白dystrophin渐变的hiPSC源心肌细胞中,端粒会经过一种复制非依赖性机制举行性延长。已知DMD小鼠模子(mdx4cv)中端粒长度的人源化可以表现出扩张型心肌病表型,在Noth单倍体不敷(Notch+/-)小鼠中科表现双尖瓣表型。利用DMD hiPSC疾病模子可以绘制端粒延长的静态图,证明并扩展了在鼠和民气脏构造中察看到的致病历程。


       文中的DMD hiPSC-CM模子和牵引力显微镜在硬水凝胶上的使用照实地归纳综合了DMD患者心肌病的特性。不但探求了DMD心肌纤维化开展前期,硬度增长侵害DMD hiPSC-CMs紧缩功效的机制,还标明心肌细胞可以赔偿安康心脏中dystrophin的缺乏,但无法赔偿生硬、纤维化的心脏,这可以表明为什么DMD患者随着年事的增加越来越容易患心律变态和心力弱竭。对差别硬度微情况的紧缩反响的特性标明,DMD心肌细胞急性机器功效停滞的开展与心脏纤维化停顿是同步的。


       端粒延长的分子触发要素大概是shelterin复合物的丧失。研讨发明DMD心肌细胞中,shelterin复合物与端粒的联合在非增殖性端粒延长开端时增加,这大概是由于缺乏dystrophin时的紧缩应激。鉴于DMD hiPSC-CMs中ROS发生增长约30%,且已知高ROS可以驱动端粒氧化并毁坏shelterin联合,因而可揣测未被掩盖的端粒反复序列的间接氧化也大概到场端粒延长。固然研讨标明shelterin在DMD hiPSC-CMs中的表达低落,但仍有待确定shelterin表达的丢失是DMD心肌细胞端粒去掩护的缘故原由照旧后果。别的,ROS的发生局部由DMD心肌细胞紧缩运动驱动。研讨发明布雷他汀拦阻端粒延长,标明紧缩功效至关紧张,但这能否是由于ROS介导的端粒去掩护或肌节构造毁坏仍有待分析。只管云云,这些数据仍支持紧缩与要害布局紧缩卵白的遗传缺失是端粒延长的次要缘故原由。别的DMD hiPSC-CMs中布局完备性的丢失大概会引发转录变革,卑鄙后遗症包罗激活DNA毁伤应对(53BP1、p53和p21卵白积聚)、线粒体殒命和代谢衰竭,与mTRG4小鼠朽迈模子和DMD小鼠“人源化"端粒模子(mdx4cv/mTRG2)分歧。


       DMD hiPSC-CMs取得“朽迈样形态"是由于53BP1、p53、p21和β-半乳糖苷酶的表达。固然端粒长度在心肌病发病机制中十分要害,但DNA毁伤应对大概会毁坏对细胞存活紧张的其他途径,如克制线粒体生物产生相干的PGC-1α。


       总之,研讨标明养分不良的心肌细胞中,端粒延长的产生与增殖有关,而且大概由紧缩诱导的ROS驱动。这提出了一个医治靶点,端粒维持,对改进或制止DMD心肌病停顿有很大推进作用。


参考文献:

Chang,  Alex C. Y. , et al. "Increased tissue stiffness triggers contractile  dysfunction and telomere shortening in dystrophic cardiomyocytes."  (2021).




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