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多重成像测定微图案化的iPSC-CMS的紧缩机器输入

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研讨配景

       心肌细胞(CMs)是心脏的肌肉细胞,经过跳动发生机器张力来维持心脏功效。CMs的机器输入泉源于沿肌纤维分列的肌节的延长。人iPS可以分解为跳动的CMs(hiPSC-CMs),但hiPSC-CMs中肌原纤维混乱,不像原代CMs中那样分列划一,这种杂乱不停是使用hiPSC-CMs举行体外心功效剖析的限定要素。基质微图案化培育hiPSC-CMs可以乐成诱导胞内肌原纤维对齐,从而加强紧缩机制的成熟度,并可将这些工程细胞作为心脏紧缩力的模子。在已知机器功能的柔性基质上微图案化培育hiPSC-CMs,经过wuchuang和微创显微法可盘算机器输入(图1A)。别的经过明视野显微镜取得的搏动细胞影像,也可跟踪细胞活动,利用可变形微柱做基质可丈量细胞力。另有研讨用构建的包罗hiPSC-CMs或与其他细胞共培育在内的多细胞体系对机器输入举行了研讨。诱导胞内肌原纤维分列是减速hiPSC-CMs紧缩成熟的要害,而肌原纤维在单细胞体系中更容易成像,可完成活细胞剖析。


       本文所述的平台整合了差别成像类办法来剖析微图案化hiPSC-CMs的机器输入,失掉了表征细胞机器输入的一系列参数。还使用该多重成像组合办法丈量了肌节长度,量化了紧缩缺陷细胞中紧缩活动的差别步性。检测了药物对hiPSC-CMs和MYBPC3基因招致紧缩缺陷的细胞的机器输入的影响。证明该办法可以剖析药理学条件下或心脏病模子中的心脏紧缩状况。


测定原理

       在每一次搏动中,心肌细胞(CMs)经过紧缩机制发生心脏功效所需的机器输入,紧缩机制包罗肌节沿肌原纤维延长。人诱导多无能细胞(hiPSCs)可分解为CMs(hiPSC-CMs),经过微图案化构成心理外形可作为模子,波动地模仿心脏紧缩机器输入。量化这些细胞的机器输入可完成在培育皿中剖析心脏运动。


测定参数

       研讨利用了Plexithermo HCell系列单心肌细胞功效检测体系。ZeissAxiovert 200M颠倒显微镜,搭载Zeiss Axiocam MRm CCD相机获取视频,剖析细胞紧缩周期的机器输入(图1A)。取得三类视频:明场视频、基质中荧光微珠的视频、荧光肌原纤维视频,表现了基质、细胞外表和肌原纤维的活动。量化每帧挪动布局(细胞、微珠和肌原纤维)的均匀位移(d)和挪动速率(V)。利用牵引力显微镜经过基质的位移预算紧缩力,盘算了由牵引应力发生的力向量(F)的巨细。F求和(ΣF),乘以V失掉功率(P)。基本这些特性(d, V, ΣF, P)绘制的曲线确定参数,接纳相互关算法Ncorr20以工夫盘算dV(图1B-F)。经过细胞界限确定感兴味地区(ROI),依据ROI确定成比例的椭圆范畴,丈量此中微珠的活动,失掉其d曲线(图1F)和V曲线(图1G)。盘算每帧的∑F,失掉F曲线(图1H)。使用工夫绘制P(图1I),量化肌原纤维活动(图1J)来确定d曲线(图1K)和V曲线(图1L)。由d曲线失掉细胞搏动率(br)。由d曲线和F曲线的峰值失掉峰位移(dmax)和峰值力(ΣFmax)。经过V曲线确定紧缩(VC)和舒张(VR)的峰值速率。经过P曲线确定紧缩(PC)和舒张(PR)的峰值功率。工夫参数()表现紧缩和舒张峰值间的工夫(图2A)。经过肌原纤维视频量化sl。胞外添加kafeiyin验证以上参数的形貌结果。证明图像剖析取得的紧缩和活动参数可以牢靠地形貌细胞的机器输入。

图1 经过显微镜视频取得hiPSC-CMs的紧缩机器输入。(A)显微镜取得的三种视频。(B)依据细胞表面确定ROI,明场视频相互关算法剖析该地区活动。(C)紧缩运动发生的细胞均匀位移(d)。(D)细胞位移的均匀速率(V)。(E)荧光视频盘算微珠的均匀位移(d)。(F)微珠的d曲线与工夫的函数。(G)微珠V曲线与工夫的函数。(H)紧缩力(ΣF)。(I)功率(P)。(J)肌原纤维中肌节占有的地区产生了骨骼化。(K)J中细胞肌原纤维的d曲线。(L)J中细胞的肌原纤维V曲线。

图2 经过画图失掉紧缩周期参数。(A)经过V曲线确定代表每个紧缩周期的3个动力学参数:VC为zuida紧缩速率,VR为zuida舒张速率,t为两峰值间的工夫。(B)增长kafeiyin浓度微珠d曲线的变革状况。(C)增长kafeiyin浓度功率P的变革状况。



       经过异丙醇(ISO)和omecamtiv mecarbil (OM)诱导hiPSC-CMs机器输入变革,使用以上参数形貌细胞变革,验证了参数牢靠性,可用于量化差别浓度药物惹起的紧缩变革(图3,图4)。

图3 异丙肾上腺素(ISO)惹起的机器输入变革。(A)牵引力显微镜测定细胞发生的牵引应力的热图。(D)荧光标志肌原纤维,成像以量化肌原纤维挪动。依据ISO处置前后的微珠视频取得F曲线(B)和P曲线(C)。依据ISO处置前后的肌原纤维视频取得d曲线(E)和V曲线(F)。(G)明场视频,取得差别浓度ISO时的d曲线(H)和V曲线(I)。

图4 检测omecamtiv mecarbil (OM)惹起的hiPSC-CM机器输入变革。(A)添加OM前的肌原纤维。(B)添加后10s内肌节急性紧缩。(C)添加2min后肌节呈现慢性毁伤。经过微珠视频取得添加OM前及发生急慢性现事后的F曲线(D)和P曲线(E)。经过肌原纤维视频取得d曲线(F)和V曲线(G)。经过细胞明场视频取得d曲线(H)和V曲线(I)。


       别的经过肌节视频还可量化ISO和OM引发的紧缩周期中肌原纤维的肌节长度(sl)和延长(ss)变革(图5),以及剖析紧缩缺陷细胞中,胞内活动的差别步性(图6)。证明该多成像办法牢靠且机动多用。

图5 ISO和OM引发的肌节长度(sl)和延长(ss)变革。经过肌节视频丈量sl和ss。(A, E)均匀sl的箱型图。(B, F)sl zuida值。(C, G)sl最小值。(D, H)sl zuida值减去sl最小值失掉ss。

图6 编码MYBPC3基因纯合子和杂合子敲除的hiPSC-CMs中,空间(αθ)或工夫(αδ)差别步性的丈量参数。(A)每个像素位移峰的工夫减去ROI均匀位移的位移峰的工夫,失掉每个像素i的δ。(B)明场视频中的ROI表示。(C)ROI中像素的δ的热图。(D-G)缺乏两个拷贝(-/-)或缺乏一个拷贝(+/-)hiPSC-CMs中取得的参数。(D)αθ。(E)αδ。(F)t。


研讨结论

       本文的多成像办法不但可表征单个hiPSC-CMs的心脏功效,还可确定分析CM功效变革的机制的紧缩参数。经过异丙肾上腺素实行,验证了该平台可检测差别药物浓度下的紧缩变革,经过OM实行证明白检测统一药物急性和慢性影响的须要性。别的该办法侵入性小,且对数据获取和剖析才能要求低,拓宽了使用范畴。总之,本文的多成像平台量化了评价hiPSC-CMs紧缩功能的要害参数。思索到肌节和紧缩活动与力发生的联系关系,该平台为丈量紧缩表型提供了多种角度和办法。


参考文献

Ribeiro,  A. J. , et al. "Multi-Imaging Method to Assay the Contractile  Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac  Myocytes." Circulation Research###83.

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