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PNAS:细胞经过水流出引发的体积改动可影响影响细胞硬度及干细胞运气

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       细胞可依据其部分微情况改动机器特征,这与决议细胞功效有关,乃至可以影响干细胞状况。美国研讨职员Ming Guo等确定了细胞硬度和细胞体积之间具有波动且一致的干系。当细胞在基质上铺展时,它的体积减小,而硬度随之增长。细胞皮质和胞质硬度会因种种扰动而随体积变革,包罗差别的基质硬度、细胞铺展面积和内部浸透压变革。细胞体积增加是水流出的后果,这也招致细胞内分子拥堵水平响应增长。别的,细胞体积变革进而硬度变革会改动干细胞分解。这些后果展现了细胞硬度和细胞体积间难以想象[nán yǐ xiǎng xiàng]的干系,对细胞生物学具有深远影响。文章以“Cell volume change through water efflux impacts cell stiffness and stemcell fate"为题宣布于PNAS


配景

       细胞体积是一个高度受调控的特征,它会影响有数功效,会随着细胞生命循环产生改动,会随着细胞质膜生长、卵白、DNA及别的包内物质的增长而增长。当细胞经过有限空间迁徙时,细胞体积也会产生疾速变革,此时体积变革是水运输到胞外完成的。而这种疾速变革会招致胞内物质及分子拥堵,从而发生诸多严峻影响。经过施加内部浸透压可迫使水流出细胞,间接使细胞体积增加,招致胞内物质浓度增长,分子拥堵度增长。别的还会改动细胞力学,招致硬度增长、影响卵白折叠和运输以及染色质凝结。这种浸透压引发的体积变革对细胞举动发生的宏大影响促生了一个题目,即等渗状况下,细胞能否会经过水外流改动体积,经过改动分子拥堵度来调治力学及举动。


       本研讨证明白当细胞培育于相反的等渗条件时,如胞外情况较硬,细胞会经过水外流增加细胞体积,这对细胞力学和细胞心理有宏大影响。当一个细胞在坚固基质上铺睁开时,它体积增加,细胞举动与施加了内部浸透压的细胞相似,即随着细胞体积减小,皮质和胞质硬度增长,而细胞核体积也随细胞体积减小而减小。别的干细胞分解受细胞体积变革的影响也很激烈。这些后果标明差别情况下的细胞可经过水外流来改动体积,引发胞内分子拥堵度变革并影响细胞力学、心理及举动,对细胞运气发生深远影响。


后果

01-施加内部浸透压状况下,细胞体积模量和剪切模量随细胞体积减小而增长


       经过添加300Da聚乙二醇(PEG300)控制内部浸透压,间接探究细胞体积变革的结果。荧光标志细胞质和细胞外表丈量细胞体积,共聚焦显微镜以3D形式辨认细胞界限。细胞饥饿一夜后成像以消弭天然细胞周期变革影响。丈量体积与已有原子力显微镜(AFM)丈量体积分歧。统一样品将共聚焦丈量后果与高辨别率布局光照分明微术(SIM)丈量后果比力,作进一步验证。两种技能测得的细胞体积分歧,标明丈量不确定度< 10%(图S1)。


       为探究细胞体积对内部浸透压的依赖性,在玻璃基底上培育A7细胞,并向培育基中参加浓度渐渐增长的PEG 300,由于PEG 300不穿透细胞膜,因而完成内部浸透压增长。由于浸透压对细胞皮质均衡的影响可以疏忽不计,而胞内浸透压由离子和小卵白质的浓度控制。因而为了赔偿内部浸透压的增长,细胞必需经过离子流入或水流出来增长其外部浸透物浓度。研讨发明细胞体积随着内部浸透压的增长而增加(图S2),去除内部浸透压后细胞体积规复到原始值,因而这是水流出惹起的。细胞在jiduan浸透压下终极可达最小体积(图S2);这反应了胞内总物质以及水合离子和卵白质所需的浸透惰性水的总体积。扫除体积的抱负气系统统中,浸透压P和细胞体积V之间的干系切合P = NkBT/(V-Vmin),此中N是细胞内浸透物数目,kB是玻尔兹曼常数,T是juedui温度,Vmin是最小体积。考马斯亮蓝丈量浸透紧缩前后每个细胞的总卵白含量,发明没有明显差别,证明细胞体积的增加是水流出所致。


       随着细胞体积的增加,胞内离子和其他物质浓度增长,去除分外的水并进一步减少细胞越来越难。水分开细胞的阻力是浸透体积模量,界说为B = -VdP/dV ~ -VΔPV。经过改动浸透压并丈量玻璃基底培育的A7细胞的总体积失掉B,发明它随细胞体积的增加而增长(图1A)。使用P对体积的依赖性,可展望体积模量即B = NkBTV/(V-Vmin)2。该函数情势与数据婚配jihao(图1A虚线)。拟合确定的Vmin值为2,053 ± 30 μm3,与jiduan浸透压下去除一切浸透活性水时测得的细胞最小体积(约2,100 μm3)分歧。拟合还提供了N值,失掉浓度约200 mM,与细胞内已知的盐浓度分歧。标明浸透压存在状况下,离子和卵白质的总量坚持类似恒定。固然浸透压均衡很大水平上受离子浓度控制,但随着游离水分开细胞,大卵白质和细胞器的浓度也会增长。正是这些卵白质和细胞器(包罗细胞核)的体积决议了Vmin。别的,随着细胞靠近其最小体积,胞内分子拥堵水平一定增长,而这大概招致细胞举动产生其他变革。


       诸多细胞特征中,细胞皮质硬度在浸透压存在时受分子拥堵度影响会随体积变革。利用光学磁性仪(OMTC)测定A7细胞的皮质剪切模量G,从而确定皮质硬度变革(图S3)。OMTC测得后果与已有AFM后果在数目上分歧。随着内部浸透压增长,皮质剪切模量和体积都疾速且同时变革(图1B)。去除内部浸透压后,皮质剪切模量立刻规复至初始值(图S2B)。细胞皮质硬度与体积模量趋向相反,可*用相反函数形貌(图1A)。拟合失掉的Vmin值为2,004 ± 41 μm3,与体积模量失掉的值十分分歧。但剪切模量的值一直比体积模量小三个数目级。这种类似性意味着分子拥堵对两者都有明显影响。


       细胞剪切模量的次要源于皮层硬度。但细胞布局呈高度异质性,外部要柔软得多;细胞的细胞质是弱弹性凝胶,其剪切模量比皮层的低三个数目级。为了丈量细胞质的硬度,将PEG包被的聚苯乙烯珠微注射到A7细胞中,激光镊子确定胞质剪切模量(图S3)。发明胞内剪切模量随细胞体积增加而增长,遵照与皮质剪切模量和体积模量相反的趋向(图1A)。随着细胞体积进一步减小,细胞质剪切模量分明增长,但值太大无法用激光镊子丈量。在可及的范畴内,胞质剪切模量与别的两个模量函数情势相反(图1A底部虚线),但比皮质剪切模量的值小三个数目级。

图1 玻璃上生长的A7细胞的机器特征与细胞体积在内部浸透压下的函数。(A)浸透体积模量(灰色三角)、皮质剪切模量(白色三角)和胞质剪切模量(空心三角)随细胞体积增加而增长。穿过灰色三角的虚线表函数B = NkBTV/(V-Vmin)2 (R2 = 0.99)的最小二乘拟合。穿过皮质和胞质模量的虚线拟合*相反,辨别缩放500和100,000倍。(B)OMTC丈量的单个A7细胞的皮质剪切模量,施加0.26 M PEG 300浸透压后立刻增长,与细胞体积增加同时产生。


02-当在较硬的基质上培育时,细胞体积减小

       皮质硬度是细胞力学的一个要害物理特征,通常随着细胞生长基质硬度的低落而低落。即便在等渗条件下细胞形状也可随基质硬度明显变革。在涂有Ⅰ型胶原的100μm聚丙烯酰胺(PA)凝胶上培育A7细胞,经过改动凝胶身分使其剪切模量可在0.1-10 kPa变革,与天然构造的心理弹性相婚配(表S1)。丈量细胞铺展面积,已知较硬基质上培育的细胞铺展面积明显增长(图2A上,图2B)。但是后果发明细胞体积并不守恒,随着基质硬度增长,细胞体积增加。在最坚固基质上生长的细胞的体积较最柔软基质上增加约40%(图2C)。其他哺乳植物细胞型,包罗HeLa、NIH 3T3、小鼠间充质干细胞(mMSCs)和原代人气道腻滑肌细胞(HASM)体现出相似的举动(图2C)。证明细胞体积依赖于基质硬度具有广泛性。因而,即便内部浸透压稳定,细胞体积也会改动。

图2 粘附细胞的形状和体积随基质硬度的增长而改动。(A)A7细胞的仰望图和侧视图,辨别牢固于涂有Ⅰ型胶原的硬(剪切模量10kPa)和软(剪切模量1200Pa)PA凝胶基质上。肌动卵白皮质(绿色),细胞核(蓝色)。(B)细胞面积随基质硬度增长而增长。(C)细胞体积随基质硬度增长而明显减小。


03-限定细胞铺展面积会使细胞体积增大

       在玻璃基底上培育A7细胞,微绘制差别巨细的胶原“岛"以限定细胞的粘附面积。发明与铺展面积不受限定的细胞相比,铺展面积受限的细胞高度更高(图3A)。别的细胞体积也随铺展面积的增加而增长(图3B)。在较软基底上培育时察看到异样结果,即假如细胞铺展面积受限小于该基底自在铺展面积,则细胞体积增长。差别粘附面积或差别基底硬度都是云云(图3C蓝色和灰色点)。


04-细胞体积增加是细胞内水流出所致

       监测一个yidanbaimei化细胞在硬基质上的铺展状况,以确定等渗条件下细胞体积增加是由于卵白质含质变化照旧由于水的流出。细胞在约20min内从最后的圆形变为*铺睁开形态。在此时期,细胞体积随着睁开面积增长而增加(图3D)。差别受限地区、差别硬度基质上,体积和睁开面积间的干系相反(图3C白色×)。水可以在一分钟内分开细胞,而哺乳植物细胞因生长而发生的胞内物质数目变革通常必要几个小时。因而等渗条件下的体积增加zuiyou大概是经过水互换来控制的。


       丈量硬基质和软基质上培育细胞每细胞的总卵白质含量,发明没有明显差别。用纯PEG置换培育基对细胞施加jiduan浸透压,从细胞中提取一切浸透活性水,发明所得最小体积Vmin与基质硬度有关(图4)。由于Vmin可大抵反应胞内物质和浸透不活泼的联合水的量,因而细胞体积的变革是由胞内游离水的互换惹起的。

图3 A7细胞体积随细胞铺展面积增加而增长。(A)玻璃上差别巨细微岛上A7细胞的3D图像。(B)随着玻璃上细胞铺展面积增长,细胞体积增加。(C)差别硬度基质上,细胞体积与投影面积的函数(灰色圆圈;n > 200)。(D)单个细胞在硬基质上静态附着时细胞铺展面积和体积的变革(n = 3)。(E)细胞体积因水流出而增加的表示图。


05-细胞铺展历程中,离子通道和肌动球卵白细胞骨架与细胞体积增加有关

       等渗条件下细胞铺展时的水流出与浸透压存在时的水流出缘故原由差别。细胞铺展历程中,细胞体积要在等渗条件下增加,为了让水分开细胞,浸透物的总量必需改动。由于每个细胞的卵白量坚持稳定,那么大概是与四周情况产生了离子互换。已知细胞铺展历程中细胞骨架张力增长,而这与离子通道活性增长有关。因而在细胞*铺展后利用0.1mM NPPB克制氯离子通道。当离子通道被阻断,随着基质硬度增长,细胞体积的增加遭到明显克制(图4B绿色空心三角)。标明等渗条件下细胞体积的增加必要离子通道活性,经过改动外部浸透物的总量来完成。


       为进一步测试活泼的细胞历程能否会影响细胞体积变革,用10μM 布雷他汀(blebbistatin)处置细胞以克制肌球卵白II活动活性,间接低落细胞骨架张力。发明布雷他汀处置拦阻了细胞在硬基质上的体积增加(图4B蓝色三角)。利用2 mM NaN3和10mM 2-deoxyglucose斲丧ATP克制一样平常活动异样察看到相似结果(图4B粉白色三角)。进一步证明等渗条件下,活泼的细胞历程与体积增加有关,细胞必需利用离子通道自动控制浸透物浓度,以影响水的流出并改动体积。

图4 药物处置和浸透压下的细胞形状和体积。(A)比较细胞和ATP耗竭细胞在jiduan渗透压下,硬基质和软基质上的三维形状。细胞质(绿色),细胞核(黄色)。(B)无自动紧缩(布雷他汀处置和ATP耗竭)且处于非常浸透压下的细胞,体积与基质硬度不呈依赖性;氯离子通道被克制(NPPB处置)的细胞,体积对基质硬度的依赖性较弱。比较细胞同图2C。


06-细胞模量对细胞体积有广泛依赖性

       等渗条件下细胞铺展面积变大,细胞皮质硬度随基质硬度增长而增长,当牢固基质硬度改动铺展面积时,细胞皮质硬度也会增长。当基质硬度和铺展面积牢固时,浸透压增长细胞硬度也增长,细胞体积减小。因而,假定细胞体积变革是一切这些状况下察看到的细胞硬度变革的配合形貌因子。将皮质硬度绘制为体积的函数,即在较软基质上生永劫,细胞硬度随体积的增长而低落(图5A)。当在牢固硬度、差别粘附面积的基质上生永劫,细胞硬度以相似的方法随体积增长而低落(图5B)。当生长在软基质上并被有内部浸透压时(图5C),以及生长在坚固且铺展面积高度受限基质上有浸透压时(图5D),细胞硬度增长。将一切数据绘制在一张图表上(图5E),数据呈现重叠而且细胞硬度与细胞体积之间体现出广泛相干性。因而细胞硬度变革可用细胞体积来形貌。本文数据都是由单一细胞范例A7取得的,其他细胞范例中只管振幅和体积上有所偏移,但也察看到相似的状况(图S4)。


       拆分数据,在不施加内部浸透压状况下,细胞只对基质硬度或铺展面积的变革做出反响,切合G ∝ 1/V2(图5E实线)。假如包罗一切数据,完备举动切合G∝kBTV/(V-Vmin)2(图5E虚线)。固然没有模子展望剪切模量的举动,但它在函数情势上与相反体积范畴内的体积模量举动相反,即B∝kBTV/(V-Vmin)2,经过丈量细胞P-V干系失掉,反应了当水从细胞中抽出时分子拥堵水平增长带来的影响。因而相似的拥堵征象也是皮质剪切模质变化的缘故原由。别的多重扰动下浸透体积模量和细胞质剪切模量都广泛依赖于细胞体积(图S5),与图1A所示的浸透压状况下一样。


       添加布雷他汀克制肌动球卵白紧缩的数据以探究细胞硬度和细胞体积之间相干性的广泛性,发明皮质硬度与体积照旧*相反的函数曲线(图5E青色五边形)。当ATP*耗尽时,数据趋向相反(图5E玄色三角形)。不但是分散的细胞,2D细胞单层中也察看到相似举动。将上皮MCF10-A细胞生长为密度差别的单层,丈量响应的细胞体积和皮质剪切模量,发明细胞体积随细胞密度的增长而增加(图S4B)。细胞体积和硬度仍旧存在相干,即随着细胞密度增长,细胞体积增加,皮质硬度增长,切合1/V2。这些后果意味着细胞体积到场决议细胞力学。

图5 细胞皮质硬度与细胞体积的干系。(A-D)差别条件下,A7细胞的细胞皮质剪切模量对细胞体积的依赖性,包罗差别硬度基质(A),差别巨细微图案的硬基质(B),剪切模量100Pa的软基质并施加渐渐增长的浸透压(C),玻璃基质上微图案限定细胞铺展并施加浸透压(D)。(E)细胞皮质剪切模量与细胞体积成比例,图示为细胞生长在差别硬度基质上(灰色圆圈),微图案限定无效铺展面积的玻璃基质上(蓝色方块),有浸透压的软基质上(剪切模量100Pa,绿色颠倒三角形),未图案化有浸透压玻璃基质(白色三角形),图案化有浸透压玻璃基质(黄色菱形),10μM布雷他汀处置(青色五边形)或ATP耗尽(玄色三角形)的玻璃基质。实线表现数据的幂律拟合。虚线表现切合G∝kBTV/(V-Vmin)2。


07-细胞核体积追随细胞体积变革

       核膜像细胞膜一样,是选择性浸透的,容许水互换。因而必要探求细胞流出的水能否也来自细胞核。用荧光标志细胞核,3D共聚焦显微镜丈量核体积。发明细胞核体积随细胞体积变革,差别基质、等渗条件下生长的细胞云云,体积因内部浸透压而改动的细胞也是云云(图6)。标明随着细胞体积的增加,细胞核也变得愈加拥堵,这对细胞核内的活动水平有间接影响。丈量了GFP标志的组卵白H2B的动摇活动。盘算均方位移,发明当内部浸透压使分子拥堵增长时,动摇程度明显低落(图6B)。

图6 细胞核体积及核动力学随细胞体积的变革。(A)细胞核体积一样平常随细胞体积变革,增加水平与基质硬度、铺展面积、浸透压力的增长成比例,测试的各细胞型中核体积与细胞体积间的比率类似恒定。(B)MCF-10A细胞核中GFP标志组卵白的均方图,反应染色质地位动摇,0.1 M PEG300jiduan浸透压状况下明显增加。


08-细胞体积改动可调控干细胞运气

       由于细胞体积与细胞硬度以及分子拥堵等其他参数有内涵联系,因而必要探求细胞体积对干细胞分解的影响。经过浸透压从内部施压使细胞体积变革,这会招致细胞硬度变革,但铺展面积和基质特征没有变革,也不会改动细胞内的张力(图S6)。在两种差别PA凝胶基质上生长mMSC,辨别为剪切模量7kPa的硬基质和剪切模量0.2kPa的软基质。软基质上的细胞体积通常较大,用0.1 M PEG 300(+100 mOsm)施加分外浸透压使两种凝胶上的细胞体积相婚配(图7 D和E)。当体积婚配时,细胞硬度也婚配(图7F)。将细胞置于支持成骨和成脂运气的双潜能分解培育基中培育1周后,经过碱性磷酸酶(ALP)活性察看。可见与软基质上未受搅扰的细胞相比,坚固基质上成骨分解明显增长。软基质+浸透压也体现出ALP活性加强,标明优先成骨分解(图7 A和B)。Western剖析成骨生物标志物runt相干转录因子2(RUNX2)和骨唾液卵白(BSP)表达证明了这一点。


       利用低渗条件(-80 mOsm)使硬基质上的细胞收缩,使细胞体积和细胞核体积与软基质上的细胞相婚配(图7 J和K)。当体积婚配时,细胞硬度也婚配(图7L)。经过油红O(ORO)原位染色中性脂质聚集,成脂生物标记物PPAR-γ表达(图7G-I)可察看到少量成脂分解。标明可以经过改动干细胞的体积来影响其向成骨或成脂偏向的分解,核内或细胞内拥堵会影响干细胞运气。


09-干细胞运气影响细胞体积

       在缺乏强化学信号的状况下,基质硬度或内部浸透压等物理特征会影响干细胞的分解。但化学信号通常可以逾越这些物理信号。在柔软的PA凝胶上培育mMSCs(倾向成脂分解),向培育基中参加增补剂(β-磷酸甘油、抗坏血酸和Dexamethasone)诱导细胞向成骨偏向分解。后果发明mMSCs举行成骨分解,且该历程中细胞体积减小,乃至成骨分解前就曾经减小(图7M)。对硬基质上的mMSCs用Dexamethasone独自化学诱导成脂,细胞体积增长(图7N)。标明细胞体积和干细胞分解亲密相干。

图7 细胞体积影响mMSCs分解。(A-F)成骨分解。(A)成骨和成脂组合诱导下mMSC培育1周后,原位染色ALP(玄色)核细胞(DAPI,蓝色),发明有浸透压时,硬基质(剪切模量7kPa)和软基质(剪切模量100Pa)上成骨分解增长。(B)mMSC成骨分解的均匀百分比。(C)mMSCs培育3天后Western剖析成骨卵白表达。(C-F)共聚焦核OMTC测得的细胞体积(D)、核体积(E)、皮质剪切模量(F)。(G-L)成脂分解。(G)组合培育2周后原位染色脂滴(白色),发明低浸透压力下(30% DI水),硬基质上成脂分解增长。(H)成脂分解均匀百分比。(I)培育1周后Western检测成脂卵白表达(PPAR-γ)。(J-L)共聚焦核OMTC测得的细胞体积(H)、核体积(K)、皮质剪切模量(L)。(M)mMSCs成骨培育培育10天后,Fast Blue染色丈量表达高程度ALP的细胞的比率。随着分解细胞比率增长,细胞体积响应增加。(N)mMSCs成脂培育基培育2周后,ORO染色丈量有分明脂滴收集的细胞比率。随着分解细胞比率增长,细胞体积呼应增长。


讨论

       本研讨数据建立了细胞体积和分子拥堵水平在决议细胞特征(包罗细胞硬度和细胞内动力学)中的要害紧张性。证明白细胞体积变革可与细胞内含水质变化间接相干,卵白和其他物质的程度坚持稳定:当底物硬度或细胞铺展面积增长时,细胞经过低落其含水量并因而增长其硬度来作出反响。固然肌动球卵白的紧缩性对这种顺应是bibukeshao的,但细胞骨架发生的应力太弱(约1-10kPa,图S6),因而细胞骨架力无法将水分挤出细胞。


       zuiyou大概的是细胞骨架的紧缩张力增长了离子通道的活性,这反过去又影响细胞间的含水量,从而影响细胞体积。这与本文发明分歧,即克制特定离子通道和ATP依赖性历程的活性时,细胞体积的变革遭到克制。皮质剪切模量和细胞体积模量的函数情势与细胞体积*相反(图S5)。体积模量举动可以了解为分子拥堵的后果,但皮质剪切模量举动的潜伏机制尚不明白。


       别的卵白质浓度变革对细胞心理有紧张影响,典范的体现是细胞体积变革对干细胞分解的影响。细胞内含水量的变革会改动细胞内分子拥堵度和细胞动力学(图6和图S7)。这无疑会使很多外部心理历程产生明显变革,如卵白质折叠和联合动力学、布局重排和转运征象以及卵白表达形式。别的,由于细胞核的体积随着细胞体积的增加而增加,相似的效应也会延伸到细胞核中(图6A),引发核内分子拥堵度改动,并大概影响层粘连卵白浓度,从而影响染色质布局、活动性,影响转录和基因表达形式。因而细胞体积和细胞核体积可以在心理条件下改动,如构造紧缩和体内浸透变革,进而影响有数的细胞历程,如信号传导、卵白质动力学,乃至干细胞分解。


参考文献:


Guo  M , Pegoraro A F , Mao A , et al. Cell volume change through water  efflux impacts cell stiffness and stem cell fate[J]. Proceedings of the  National Academy of Sciences, 2017, 114(41):201705179.

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