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Science:基质弹性调治培育中的骨骼肌干细胞的自我更新

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       自然存在于成体构造中的干细胞,如肌肉干细胞(MuSCs),在体内体现出壮大的再生才能,而一旦培育则会敏捷丢失。因而美国和瑞士研讨职员P. M. Gilbert等利用生物工程基质模仿要害的生物物理和生归天学微情况特性,联合高度主动化的单细胞跟踪法,证明基质弹性是培育中MuSCs运气的强力调治因子。与硬塑料(约106 kPa)上培育的MuSCs差别,在模仿肌肉弹性的软水凝胶基质(12 kPa)上培育的MuSCs会在体外自我更新,而且进一步移植到小鼠体内后,经过wuchuang生物发光成像举行构造学和定量剖析发明,MuSCs还可普遍促进肌肉再生。再次证明经过模仿心理构造硬度,可完成成体肌肉干细胞的繁衍,对将来的细胞疗法有极大启示作用。文章以“Substrate Elasticity Regulates Skeletal Muscle Stem Cell Self-Renewal inCulture"为题宣布于SCIENCE


配景

       很多成体构造含具有明白特性及明显再生才能的干细胞。假如干细胞在分散后立刻从一个个别移植到另一个个别,这种特征将被保存,而医治使用中,一旦干细胞置于平板培育以增长其数目,这种特征就消散了。当移植到小鼠体内时,肌肉微情况(niche)使新分散的肌肉干细胞(MuSCs)能普遍促进骨骼肌再生。而尺度构造培育塑料板上生长的MuSCs则得到了“干细胞性",取得的祖细胞再生潜力和医治潜力都大大低落。只管对生化信号举行了普遍研讨,但现在仍无法完成对包罗MuSCs在内的培育中的功效性成体干细胞举行繁衍。已知生物物理特征如基质硬度可改动培育中细胞的分解。本研讨测试了一个假定,即弹性模量在肌肉干细胞自我更新及其在肌肉再生中的功效中发扬要害作用。研讨发明当MuSCs培育于模仿肌肉构造硬度的基质上时,可自我更新发生具有修复受损肌肉潜能的干细胞,可有助于克制成体干细胞医治使用上的一个次要停滞。与诱导多无能细胞(iPS)或必需定向分解的胚胎干细胞差别,该战略使用了具有确定特性和功效的自然构造干细胞。


后果

       为模仿肌肉硬度并将生物物理与生归天学效应分散,研讨职员构建了一个可调的聚乙二醇(PEG)凝胶平台。经过改动前体溶液中PEG的百分比,发生具有肯定硬度范畴的水凝胶(图1A和B),包罗模仿成体鼠骨骼肌弹性模量(图1A和C)。传统上用于细胞培育的聚苯乙烯塑料板的弹性模量约3GPa,比骨骼肌硬5个数目级以上。层粘连卵白(laminin)是自然MuSCs微情况的身分之一,与水凝胶网络共价交联并用作粘附配体(图1B底部)。为确保层粘连卵白密度及外表化学在水凝胶和塑料培育条件下坚持分歧,制造了聚合后不收缩的凝胶(图1D),并在塑料外表浇筑一薄层PEG水凝胶(≤1mm),使MuSCs可以感知到上面塑料的硬度(图1D)。


       将MuSCs分散并以单细胞程度剖析,柔软或坚固的培育外表以微孔阵列图案化(图1E),由于即便以荧光激活细胞分选富集,干细胞群体也存在内涵的异质性。利用微孔技能可完成延时获取数百个单一干细胞,但剖析由此发生的少量数据集很有难度。因而研讨职员开辟了高度主动化的算法,称为Baxter算法(SOM),它能跟踪多个细胞破裂的谱系干系。该算法将数据剖析工夫增加了约90%,错误率仅为1%。


       经过延时收罗和主动跟踪创建由单个细胞衍生的克隆谱系汗青(图1E)。与柔软(99mm/h)培育基质相比,在坚固(120mm/h)基质上的MuSC速率增长,与已有研讨结论分歧。别的细胞面积随着细胞复制及其内容物的增长而增长,并在有丝破裂后回到初始细胞面积,进一步证明白支解参数的准确。


       在柔软水凝胶基质上培育的MuSCs并不会履历先前培育中报道的“危急"或少量殒命。

  

       培育1周后,软微孔中发生克隆的细胞数目是硬微孔中的2倍。经过Baxter算法可在克隆程度上形貌这种征象。在坚固基质上,总细胞数并不会随工夫变革,由于破裂与细胞殒命相抵消;而在柔软基质上,细胞殒命增加,总细胞数随工夫增长(图1G)。两种状况下细胞都不会忽然殒命,细胞殒命与工夫和细胞破裂数有关(图1G)。数据证明在软基质上培育可进步MuSC存活率。



图1 柔韧水凝胶提拔培育中MuSC的存活率并避免分解。(A)具有可调机器特征的PEG水凝胶。杨氏模量(E)与前体聚合物浓度呈线性相干;红圈为肌肉弹性。(B)绿色刮刀上的柔韧PEG水凝胶图像。水凝胶的共聚焦免疫荧光图像,以将层粘连卵白微打仗打印于水凝胶微孔底部。(C)流变仪剖析胫骨前肌肌肉(n=5小鼠,共10个肌肉)。(D)差别硬度PEG水凝胶间,凝胶外表卵白密度没有明显差别(E;P>0.05),为7.6ng/cm2 ± 1.0ng/cm2(n>4)。(E)Baxter算法剖析延时视频。无数百个含单一MuSCs微孔的水凝胶阵列耽误显微成像3天。视频主动加工并剖析。(F)单一MuSC(玄色点)在柔软或坚固培育基质上的速率。圆圈表现均速 ± SD(P<0.0001)。(G)耽误剖析时期柔软(顶部)或坚固(底部)基质上总MuSC数的变革。殒命(X)和破裂(O)。


       基质硬度也会影响基因表达,表示柔软外表上的MuSC的干细胞性失掉保存。在柔软基质上培育1周的MuSCs,发生表达肌天生素(myogenin,分解的MuSCs表达的肌源性转录因子)的细胞,数目较培育于硬基质上的MuSCs多1/3。延时剖析在MuSC最开端破裂或破裂间都没有察看到统计学差别,因而扫除了细胞破裂差别招致基因表达差别的大概性。别的,软硬基质间的破裂率也没有差别。标明基质硬度对培育中的细胞的破裂率没有影响,但大概会制止分解并经过进步生活才能使细胞数目增长。


       为证明柔韧基质上培育的MuSCs可坚持干细胞性,体内评价了MuSCs的功效。从构成性表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光卵白(GFP)的小鼠中分散MuSCs,培育7天。劳绩细胞并计数,培育的MuSCs子代移植到免疫缺陷小鼠的胫骨前肌(TA),该小鼠经18Gy腿部照射去除了内源MuSCs。经过wuchuang体内生物发光成像(BLI)与细胞数相干的荧光素酶活性,定量剖析供体细胞随工夫的举动(图2A)。将构造学检测到供体源肌纤维对应的生物发光值设置为植入阈值。这种体内功效剖析对验证培育的MuSCs的干细胞性至关紧张。


       体内功效剖析标明,培育于与肌肉构造心理模量想婚配的基质上的MuSCs可zuiyouxiao坚持干细胞性。与之前的陈诉分歧,塑料上培育的MuSCs植入明显增加(图2B)。移植了培育于最柔软水凝胶上MuSCs的小鼠,生物发光信号zuiqiang,而移植了培育于最坚固基质上MuSCs的小鼠,植入水平和植入率都低落(图2B)。与构造培育塑料相比,模仿骨骼肌弹性(12kPa)的培育基质是weiyi招致小鼠MuSC植入百分比有统计性明显增长的条件(图2C)。


       为确定具有植入潜力的培育细胞的比例,将MuSCs在柔软或坚固基质上培育1周,随后浓缩剖析。移植了培育于坚固塑料性基质干细胞的小鼠,均未表现出高于检测阈值的BLI信号(图2D红圈)。相比之下,当移植1000个以下水凝胶(12kPa)培育的干细胞时,植入产生率为baifenzhibai(图2D玄色圈),与新分散的细胞相似。仅移植10个水凝胶培育细胞的小鼠中,有10%植入(图2E),与移植10个新分散细胞状况的程度(16%)相称。



图2 培育MuSC的植入受基质弹性调治。(A)体内移植实行方案。(B)受体小鼠移植100个GFP/Fluc MuSCs后1个月的BLI值散点图,MuSCs在差别硬度基质上培育7天(左;n=15)。移植了差别培育条件下细胞的小鼠的生物发光图像(右)。(C)高于植入阈值的BLI值实行条件的百分比。Fisher’s准确查验P<0.05。(D)Fluc MuSCs在水凝胶(玄色)或塑料(白色)上培育7天,以差别数目移植1个月后,受体小鼠BLI值的散点图。移植了差别培育条件下细胞的小鼠的生物发光图像(右)。(E)各实行条件下呈BLI值在植入阈值以上的移植后小鼠的百分比。


       体内移植时,培育于模仿肌肉构造的基质上的MuSCs展示出相似新分散MuSCs的静态增殖举动。两细胞群都履历了一个普遍的增殖时期,终极抵达平台期并波动,完成静态均衡(图3A)。构造学判定GFP+肌纤维泉源于再生,是由新分散或培育于柔软基质上的MuSCs再生取得(图3B)。只管新分散的与生善于柔软基质的MuSCs失掉的植入率相称(图2C),但培育的MuSCs的植入范畴并不如新分散细胞那样微弱(图3A),标明要体外培育大概还必要分外的生化要素,以涵盖完成体内zuida功效所需的其他要害微情况身分。培育于柔软基质的MuSCs一旦移植到肌肉中,可规复到其自然的卫星细胞微情况,这是新分散MuSCs的典范特性。从表达LacZ(受Myf5启动子调控)的小鼠中分散MuSCs并培育于柔软水凝胶上,随后移植到小鼠中。劳绩构造前,用虎蛇毒素(notexin)毁坏受体肌肉,使MuSCs激活并使肌源性转录因子Myf5表达上调。构造学剖析β-半乳糖苷酶染色发明,与新分散细胞相似,在基底层之下和肌纤维之上的卫星细胞微情况中,也发明了表达Myf5的移植水凝胶培育细胞(图3C)。



图3 于柔软水凝胶中培育可促进肌肉干细胞植入及体内微情况重修。(A)经过BLI在移植后30天内监控新分散(黑线,方块;500细胞)、柔韧基质(绿线,圆;1500细胞)、坚固基质(红线,菱形;1500细胞)上MuSCs的植入。(B)移植新分散(左;500移植细胞)或柔软水凝胶培育1周(右;2500移植细胞)的MuSCs1个月后,肌肉横切面免疫荧光检测GFP表达。GFP,绿色;层粘连卵白,白色;Hoechst,蓝色。(C)免疫组化剖析移植了培育于柔软基质MuSCs后1个月的横向肌肉构造。箭头所示为卫星细胞地位的供体源细胞。β-半乳糖苷酶,绿色;层粘连卵白,白色;Hoechst,蓝色。


       干细胞的典范特性之一是可经过破裂或自我更新取得更多拷贝。经过一些简明的体外办法已证明MuSC培育时会产生不合错误称和对称破裂,与自我更新分歧。本研讨用分散自Pax7-ZsGreen转基因小鼠的MuSCs,体外剖析MuSC的基因表达,标明柔软的基质支持自我更新。察看到柔软微孔中,32%的doublets(单个细胞破裂发生的两个细胞)呈Pax7(MuSC标记物)阳性(图4A,B)。相反,塑料微孔中只要6%的doublets阳性,标明柔软基质可使MuSC扩增。只管基因表达数据很有提醒性,但体内功效剖析照旧必须的,以终极确定培育中产生了自我更新破裂工夫。


       经过体内功效剖析确定了干细胞产生了自我更新。以细胞群程度移植MuSC证明产生了植入(图2和3),但并未终极标明培育中产生了自我更新破裂,由于细胞群中大概含有坚持了干细胞特征的非破裂细胞。因而本实行将MuSCs铺于水凝胶微孔阵列中,并在铺种细胞后立刻成像,在培育后2-3天成像以辨认只含1个doublet的微孔。用显微操纵器获取并搜集5个微孔中的doublets,共10个细胞,云云,每只小鼠移植10个细胞(图4A)。可检测到BLI信号标明5个移植doublets中至多有1个产生了自我更新破裂,完成了植入。移植了培育于柔软基质doublets的小鼠中,有25%(3/12)可检测到植入(图4C),而且促进肌纤维再生(图4D顶部),提供了体内功效性证据,即柔韧基质培育的MuSC产生了自我更新破裂事情。生善于坚固塑料微孔上的doublets移植后从未展示出植入(0/14)(图4C),标明其再生潜力敏捷丢失。


       即便多此破裂后,柔韧水凝胶上的MuSC也会自我更新。将破裂3-5次后的单细胞生长出的克隆移植到小鼠体内。后果发明移植了单克隆的小鼠有12%(1/8)展示出植入,证明柔韧基质上培育的MuSC即便多此破裂后仍然坚持自我更新才能(图4C,D底部)。



图4 于柔软水凝胶培育可促进肌肉干细胞自我更新。(A)体内自我更新剖析方案。(B)柔软(n=47)或坚固(n=32)微孔中,展示出Pax7+/+基因特性的doublets的百分比(右)。一个Pax7+/+ doublet的图像(左)。自然Pax7-ZsGreen,绿色;Hoechst,蓝色。(C)移植了柔软(n=12)基质或坚固(n=14)微孔中doublets,或柔软微孔中克隆(n=8)的小鼠的生物发光值散点图(左)。生物发光值在阈值以下的小鼠图像(右)。(D)移植5个培育于柔软水凝胶上的MuSC doublets(顶部,GFP+纤维纵向约13mm)或单个克隆(底部,纤维纵向约7mm)1个月后,肌肉横切面免疫组化检测GFP表达。GFP,绿色;层粘连卵白,白色;Hoechst,蓝色。


结论

       本文探求了构造硬度(一种骨骼肌微情况的生物物理特征)对干细胞运气调治的影响力。经过用单细胞追踪算法以单细胞程度评论MuSC举动,证明白柔软基质可进步MuSC存活,避免分解并提拔干细胞性。在小鼠中举行的功效性剖析终极标明,柔韧基质容许培育中的MuSC自我更新。固然潜伏机制仍有待分析,但可以假定硬度的增加改动了细胞外形,引发细胞骨架重排及信号通路改动,从而坚持了干细胞性。只管对单一参数,硬度,干细胞性可明显保存,但ag真人仍希冀经过将分外的生化线索添加到平台中来进一步加强干细胞性。使用如本文所述的这种仿生培育平台举行的研讨,可在促进体外增殖的同事保存干细胞性以及再生构造的才能,对干细胞研讨具有普遍影响,也是开展细胞疗法的要害一步。


参考文献

Gilbert  P M ,  Havenstrite R L ,  Magnusson R E G , et al. Substrate elasticity  regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture.[J].  Science, 2010, 329(5995):1078-1081.




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