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压力驱动的线粒体转移途径发生所需遗传组合和运气的哺乳植物细胞

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       发生具有所需线粒体DNA(mtDNA)序列的哺乳植物细胞有助于研讨线粒体、疾病建模和潜伏的再生疗法。美国研讨职员Alexander N. Patananan等开辟了一种高通量线粒体转移安装——MitoPunch,经过将小鼠某人类细胞分散出的线粒体转移到原代或永生的mtDNA缺陷(ρ0)细胞中,发生具有特定mtDNA-nDNA (核DNA)组合的细胞。波动的分散线粒体受体(stable isolated mitochondrial recipient, SIMR)细胞经限定性培育基分散,可以yongjiu保存供体mtDNA偏重新取得呼吸作用。但是,只管在限定性培育基中生长,SIMR成纤维细胞仍坚持ρ0样细胞代谢组和转录组。研讨职员将非永生的SIMR成纤维细胞重新编程为诱导多无能细胞(iPSC),随后分解为多种功效细胞范例,包罗间充质干细胞(MSC)、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。重编程和分解后,SIMR成纤维细胞在分子和表型上与比较成纤维细胞相似。因而,利用MitoPunch可以消费具有dute mtDNA-nDNA组合的SIMR细胞,可用于多种细胞范例的研讨和使用。文章以“Pressure-Driven Mitochondrial Transfer Pipeline Generates Mammalian Cellsof Desired Genetic Combinations and Fates"为题宣布于Cell Reports


介绍

       哺乳植物线粒体是细胞的动力工场,在细胞凋亡、活性氧(ROS)和Fe-S簇天生、Ca2+调治、代谢物发生方面有帮助作用。每个线粒体含凌驾1,100个由细胞核编码并导入的卵白质,此中少量拷贝为圆形约16.5 kbp的线粒体基因组(mtDNA),编码13种电子通报链(ETC)和呼吸所需的卵白质。多达1:5,000的人存在mtDNA渐变,这种渐变会侵害高能量需求构造并引发衰竭性疾病,包罗癌症、糖尿病和代谢综合征。别的,细胞大概包括差别mtDNA序列的混淆物,这种状况被称为异源性(heteroplasmy),多达1/8的无症状个别携带未知的致病性mtDNA渐变。因而可控利用mtDNA序列可以完成对线粒体的研讨,并有大概开辟mtDNA病的疾病模子或疗法。


        在人类生殖范畴已有几种线粒体交换战略,可将受精卵中的致病mtDNA与安康供体卵母细胞中的有害mtDNA互换。这些办法无望避免mtDNA非常从携带者母亲感染给其后代。但是体外改动体细胞和构造内mtDNA序列的办法仍存在肯定限定。细胞交融发生的“胞质杂合体(cybrids)"可以yongjiu保存供体线粒体。别的导入线粒体的核酸内切酶可以经过靶向特定序列举行毁坏,从而改动异质比率来改动线粒体和细胞功效。但这些核酸内切酶消费过于费力的、范围于某些mtDNA序列、服从低,而且产品差别质。利用细菌胞苷脱氨酶(DddA)可编辑mtDNA单碱基序列,但服从低且脱靶率令其不尽善尽美[jìn shàn jìn měi]。


       现在有几种办法可将分散的线粒体转移到mtDNA缺陷细胞[称为ρ0 (rho null)细胞]中,以规复呼吸作用。别的另有研讨报道了哺乳植物细胞对线粒体的内吞作用。但是这些研讨的重点并不是援救ρ0细胞及发生可以yongjiu保存供体mtDNA的,波动的分散线粒体受体(stable isolated mitochondrial recipient, SIMR)克隆。有研讨经过将高浓度的分散的供体HEK293T线粒体与ρ0骨血瘤细胞共培育,发生了数目有限的SIMR克隆。相似的另有细胞可以内吞外源线粒体,乃至在有限的工夫内(约1周)改动代谢功效,但这些外源mtDNAs会随工夫的推移而丧失。光热纳米叶片可办理这个题目,波动地将大批分散的线粒体转移到ρ0骨血瘤细胞中。但纳米刀片费时费力的且产量低,三个SIMR克隆中有两个改动了ρ0细胞代谢组。因而必要可以发生少量非转化的波动克隆的新技能,以经过重编程发生多能性并分解为多种细胞范例来研讨差别mtDNA-nDNA(核DNA)组合。


       本文形貌了一种复杂易用的线粒体转移技能,称为“MitoPunch",以疾速天生少量未转化的SIMR克隆。使用MitoPunch举行了一套“流水线"实验,证明白供体mtDNA在差别细胞运气下的受体宿主原代细胞中具有功效。借由本研讨创建的办法,使用非永生化质料发生了原代SIMR细胞。还以确定的mtDNA-nDNA组合丈量了SIMR细胞的代谢组学、转录组学和生物物感性质形态,对未来发生具有所需的mtDNA-nDNA组合的体细胞的研讨具有引导作用。


后果

01-MitoPunch发生差别细胞范例和mtDNA的SIMR细胞


        MitoPunch是一个基于光热纳米刀片和生物光子激光帮助细胞手术东西(biophotonic laser-assisted cell surgery tool, BLAST)技能的大范围并行、压力驱动的大型转运平台。MitoPunch利用机器柱塞使柔韧的聚二甲基硅氧烷(PDMS)储器产生物理变形,储器中含1×PBS(pH 7.4)分散的线粒体悬浮液(图1A)。柱塞驱动推进PDMS保送室中的悬浮物经过多孔膜,多孔膜包括很多直径3μm的孔,生长有一层粘附细胞。这种作用间接迫使分散的线粒体进入受体细胞的胞质溶胶。


        为证明MitoPunch可以发生SIMR细胞,将分散自约1.5 × 107个HEK293T细胞的线粒体转移至约2 × 105个143BTK-ρ0骨血瘤细胞中。转移后利用尿苷缺乏培育基选择并分散可以yongjiu保存供体mtDNA的SIMR克隆。由于呼吸缺陷型ρ0细胞具有无活性的二氢硼酸脱氢酶,而且依赖外源尿苷或规复呼吸来举行嘧啶生物分解,因而这种挑选是可行的。比拟同数目线粒体与细胞的共孵育实行,只要MitoPunch发生的带有HEK293T线粒体的143BTK-ρ0细胞(143BTK-ρ0+HEK293T)yongjiu保存了供体mtDNA,并在尿苷缺乏的培育基选择中存活(图1B)。在一组有代表性的线粒体转移实行中,MitoPunch发生了约75个独立的结晶紫染色的SIMR克隆,相比之下共孵育没有取得克隆(图1B)。


       接上去研讨MitoPunch否能发生带有明白mtDNA-nDNA对(可以通报线粒体疾病特性)的SIMR克隆。线粒体辨别来自含A3243G mtDNA替换物的胞质杂合体,该渐变常与线粒体脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)相干,以及统一个别野生型(WT)细胞。已知A3243G点渐变位于tRNALEU基因,会招致ETC复合物的发生和组装产生改动,使氧化磷酸化受损。MitoPunch将线粒体导入143BTK-ρ0受体细胞并选择培育2周后,取得数十个yongjiu保存MELAS(143BTK-ρ0+MELAS)或WT(143BTK-ρ0+WT) mtNDA的独立SIMR克隆,用Seahorse Extracellular Flux Analyzer测试此中2个克隆的耗氧率(OCR)。后果表现与患者婚配的143BTK-ρ0+WT和自然143BTK比较细胞相比,143BTK-ρ0+MELAS克隆的底子呼吸、zuida呼吸和备用呼吸才能明显受损(图1C ),标明MELAS表型的次要代谢缺陷已经过的波动mtDNA转移完成。


       扩展线粒体供体和受体细胞配对范畴,以证明MitoPunch的多功效性。从C57BL/6小鼠构造中分散线粒体,MitoPunch将其转移到C3H/An衍生的L929 ρ0永生化成纤维细胞中。选择两周后每个线粒体泉源发生了几十个SIMR克隆。相较于承受了低能量需求的脾或shenyuan线粒体的SIMR克隆来讲,承受高能量需求的心脏、肺或肌肉源线粒体发生的SIMR克隆表现出zuiqiang健的呼吸特性(图1D)。还评价了用MitoPunch将异质mtDNA混淆物导入细胞。选择有mtDNA渐变的小鼠胞质杂合系统分散线粒体,辨别为细胞色素B(mt-Cytb)、NADH脱氢酶亚基4(mt-nd4)和NADH脱氢酶亚基6(mt-nd6)基因渐变,利用MitoPunch将线粒体独自或与卵白1:1比例转移到L929 ρ0成纤维细胞中。具有单一渐变mtDNA源的SIMR细胞持续体现出严峻的呼吸毁伤(图1E)。而含有非重叠渐变线粒体基因的SIMR细胞表现出分明改进的呼吸特性,无力标明两种线粒体基因都失掉波动保存(图1E)。因而MitoPunch和细胞挑选可作为一种通用办法,来发生具有所需mtDNA-nDNA对的人或小鼠SIMR细胞。将多品种型的mtDNA共转移到统一受体细胞中,也可作为检测渐变mtDNA混淆物的互补的一种复杂办法。



图1 MitoPunch是一种多功效线粒体转移技能。(A)MitoPunch线粒体转移平台表示图。(B)共孵育或MitoPunch通报,1×PBS(pH7.4)(比较)或HEK293T细胞线粒体,转移到143BTK-ρ0骨血瘤细胞中,去尿苷培育基挑选后的结晶紫染色SIMR克隆。数据为3次技能反复的均值±SD。(C)Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer 丈量的OCR,辨别为约1.5×104的143BTK-、143BTK-ρ0、WT cybrid、MELAS cybrid, 143BTK-ρ0+MELAS SIMR、143BTK-ρ0+WTSIMR。数据为4次技能反复的均值±SD。


02-MitoPunch发生非转化的非恶性SIMR细胞

       为利用非永生化受体细胞取得含mtDNA-nDNA组合的SIMR细胞,创建了一套人成纤维细胞线粒体受体通报办法。用2’,3’-dideoxycytidine (ddC)处置Hayflick-limited BJ包皮(BJ)成纤维细胞、复活皮肤成纤维细胞(NDFs)和成人皮肤成纤维细胞(ADFs)3周,以耗尽内源性mtDNA。原代ρ0人成纤维细胞辨别用qPCR和Seahorse assay检测不到mtDNA(图S1A和S1B)和细胞呼吸(图S1C和S1D)。由于ddC大概招致nDNA改动,经过全基因组测序反省了BJ ρ0成纤维细胞,发明只要多数非同义渐变,均匀每兆碱基0.6个渐变,没有染色体断裂,DNA拷贝数也没有变革(表S1)。


       将从人外周血单核细胞(PBMC1)分散的线粒体转移到奇怪ρ0成纤维细胞中,随后尿苷缺乏的半乳糖培育基选择。从5-10个BJ成纤维细胞、NDFs或ADFs中,分散出ρ0+PBMC1 SIMR克隆,克隆表现了准确的mtDNA-nDNA序列对和人白细胞抗原(HLA)受体细胞单倍型(图2A–2C)。独立的PBMC2和HEK293T细胞线粒体转移也取得了原代、非永生的SIMR克隆。察看到HEK293T细胞和PBMC2线粒体转移的服从多变,ADFs ρ0+PBMC2没有发生克隆(图S1E)。对含23个BJ ρ0+HEK293T SIMR克隆的少量培育物的剖析证明了mtDNA-nDNA对以及HLA单倍型准确(图S1F和S1G)。


        经过Seahorse assay检测BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293TSIMR成纤维细胞的呼吸功效,后果表现与BJ ρ0成纤维细胞相比,两种SIMR细胞范例的底子和zuida呼吸以及备用呼吸才能均有统计学改进,只管仍低于比较BJ成纤维细胞的程度(图2D和S1H)。免疫荧光(IF)显微表现,BJ ρ0成纤维细胞具有片断化的线粒体网络形状,缺乏含mtDNA的线粒体类核,如之前对ρ0细胞察看到的那样(图2E)。相比之下自然的BJ成纤维细胞表现出网状线粒体网络,每个细胞有几十个线粒体类核(图2E)。依据IF类核雀斑数,BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR细胞好像都将mtDNA含量规复到相称于或凌驾自然BJ成纤维细胞的程度(图2E和S1I)。SIMR细胞线粒体表现出相似于自然BJ成纤维细胞的网状线粒体网络形状,只管具有更麋集和更肿胀的线粒体(图2E和S1I)。只管SIMR成纤维细胞yongjiu地保存了供体mtDNA,OCR和IF表现转移的mtDNA的夹杂作用招致细胞特性处于BJ ρ0和自然BJ成纤维细胞之间。



图2 SIMR成纤维细胞的发生。(A)从ρ0原代人成纤维发生SIMR细胞的选择流程(天),以及SIMR克隆消费服从数据。从约3×107个PBMC1分散的线粒体经MitoPunch转移到BJ ρ0、NDF ρ0或ADF ρ0受体成纤维细胞中。选择培育后,SIMR克隆用结晶紫染色并计数。(B)BJ、PBMC1、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞的D-loop高变区mtDNA序列。箭头表现单核苷酸多态性。(C)用OptiType v.1.3.1算法取得的自然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞的次要构造相容性复合体HLA A、B、C的基因座基因分型。(D)Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer丈量的约1.5×104数目的自然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞的OCR。数据为4次技能反复的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test丈量明显性。(E)自然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞免疫染色代表图像,双链DNA(dsDNA)(绿色)、TOM20(白色)、共定位(黄色)。图像(100×)由Leica SP8共聚焦显微镜取得,比例尺15μm。也可见图S1和表S1。


03-SIMR成纤维细胞是可重编程的


       用OCT4SOX2KLF4cMYCNANOGLIN28 RNAs使BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293TSIMR成纤维细胞以及自然BJ成纤维细胞重编程,并对TRA-1-60+染色克隆定量。两个独立实行中,自然BJ成纤维细胞发生均匀136个重编程的TRA-160+克隆(0.068%),而BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T细胞辨别发生21个(0.011%)和3个(0.0015%)克隆(图3A和S1J)。检测了BJ ρ0+PBMC1-iPSCs (1、2和11)和BJ ρ0+HEK293T-iPSCs (1、2和4)的三个重编程克隆的多能性生物标志物,并经过流式细胞术检测OCT3/4和SOX2转录因子染色阳性,BJ诱导的iPSC比较也是云云(图3B和S1K)。相反在一切重编程的BJ ρ0+PBMC1-iPSC、BJ ρ0+HEK293T-iPSC和比较BJ-iPSC克隆中,分解细胞生物标记物CD44均为阴性,仅在自然BJ成纤维细胞中免疫染色(图3B和S1K)。IF检测BJ-iPSC和一切SIMR-iPSC重编程克隆也是SSEA-4+和OCT4+(图3C和S1L)。Seahorse剖析BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆表现,在底子呼吸、zuida呼吸和备用呼吸才能上,与自然BJ-iPSC的统计差别最小或没有(图3D和S1M)。因而SIMR成纤维细胞重编程发生了带有供体mtDNA的iPSCs。



图3 SIMR成纤维细胞可被重编程。(A)用显微镜计数的TRA-1-60+的iPSCs克隆,由自然BJ和SIMR成纤维细胞重编程取得。数据为生物反复均匀值。BJ成纤维细胞比较的数据为图S3A中统一数据。(B)流式细胞术测定多能性生物标记物SOX2和OCT3/4,以及成纤维细胞生物标记物CD44。免疫染色样品以黑色表现,同型阴性比较以灰色表现。所示为自然BJ成纤维细胞和BJ-iPSC以及BJ ρ0+PBMC1-iPSC细胞数据。自然BJ成纤维细胞和BJ-iPSCs的数据与图S3B相反。(C)自然BJ成纤维细胞(阴性比较)、BJ-iPSC(阳性比较)和三个BJ ρ0+PBMC1-iPSC克隆的代表性相差图像及IF显微图像,对多能性生物标记物SSEA-4和OCT4举行免疫染色。比例尺100μm。(D)约1.5×104个自然BJ-iPSCs和BJ ρ0+PBMC1-iPSC克隆1、2和11的OCR丈量值。BJ-iPSC比较的数据与图S3D相反。数据为4次技能反复的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test盘算明显性。另见图S1和表S2。


       有研讨标明致病性mtDNA渐变个别的成纤维细胞产生了iPSC重编程,但还没实验用于含供体的、非自然渐变mtDNA的SIMR成纤维细胞。因而研讨职员分散了含A3243G MELAS mtDNA渐变或WT mtDNA的线粒体,由MitoPunch转移到BJ ρ0成纤维细胞中并选择。BJ ρ0+MELAS SIMR成纤维细胞在重编程历程中体现出增殖缺陷,而且不发生iPSCs(数据未表现)。因而改用NDF ρ0受体成纤维细胞,利用MELAS(NDF ρ0+MELAS)、WT(NDF ρ0+WT)或NDF(NDF ρ0+NDF)线粒体发生SIMR成纤维细胞。Seahorse剖析表现,与自然NDF、NDF ρ0+NDF和NDF ρ0+WT相比,NDF ρ0+MELAS成纤维细胞的底子呼吸、zuida呼吸和备用呼吸才能明显低落(图S1N)。限定性片断长度多态性(RFLP)PCR剖析证明发生了同质NDF ρ0+MELAS SIMR成纤维细胞(图S1O)。RFLP剖析还证明发生了约25%-50%的异质NDF ρ0+MELAS/WT成纤维细胞(图S1O)。同质NDF ρ0+MELAS成纤维细胞用前文RNA办法举行异样的重编程,但一切发育中的iPSC克隆都产生了自觉分解(图S1P)。NDF ρ0+MELAS/WT异质成纤维细胞的重编程(图S1O)发生20个iPSC克隆,但RFLP剖析发明一切克隆仅保存了WT mtDNA(图S1P和S1Q)。为查验重编程办法能否影响渐变型mtDNA SIMR-iPSC的发生,用整合DNA、慢病毒和仙台病毒重编程NDF ρ0+MELAS成纤维细胞。在一切状况下,只管有重编程的晚期迹象,NDF ρ0+MELAS细胞照旧自觉分解(表S2)。别的在增补尿苷、抗氧化剂N-acetylcysteine [Rho相干卵白激酶(ROCK)克制剂]或低氧张力举行重编程时,均未取得NDF ρ0+MELAS-iPSCs(数据未表现)。别的4种包括分外mtNDA渐变的NDF ρ0 SIMR成纤维细胞重编程战略也取得了相似的后果,渐变包罗细胞色素B缺失、Kearns-Sayre罕见缺失、A8344G或T8993G mtDNA交换(表S2)。因而SIMR成纤维细胞容易坚持少量的mtDNA序列,与SIMR-iPSCs相反,后者只能用有害的mtDNA序列发生。必要进一步的生化研讨来确定mtDNA序列怎样决议SIMR重编程。


04-SIMR-iPSCs发生功效性的、分解的细胞范例

      

       接上去确定了具有等基因核和非自然供体mtDNA的SIMR-iPSCs可否分解。鉴于间充质干细胞(MSCs)在医治及多项临床实验中的使用潜力,选择其作分解研讨工具。BJ-iPSC比较、BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK293T-iPSC被分解为MSC,并用针对外表生物标记物的抗体组举行验证。流式细胞术验证了BJ BJ-MSC比较、BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆中,MSC生物标记物CD73、CD90和CD105呈阳性,非MSC生物标记物cocktail呈阴性,包罗CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR(图4A和S1R)。BJ-MSCs和来自两个mtDNA供体的一切SIMR-MSC克隆都可粘附在塑料上,切合ISCT的MSCs尺度(图4B和S1S)。


       Seahorse剖析BJ-MSC比较、BJρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆表现,底子呼吸、zuida呼吸和备用呼吸才能没有差别或略有差别,标明ρ0成纤维细胞在MitoPunch及重编程和分解后,呼吸变革并不波动(图4C和S1T)。定量相位显微(QPM)反省SIMR MSCs的要害细胞生物物理特征,发明BJ-MSC比较、BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK 293T-MSC克隆的细胞生长率、面积和生物量差别极小或无差别(图4D和S1U)。经过尺度免疫克制实验(可检测MSC临床免疫调治功能),与人PBMC分散的T细胞共培育,比力SIMR-MSC克隆和BJ-MSC比较的功效。发明一切BJ ρ0+PBMC1-MSC和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆都克制T细胞增殖(图4E和S1V)。BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆11表现出zuida的免疫克制和T细胞增殖的增加,而其他SIMR-MSC克隆和BJ-MSC比较间没有检测到大的差别。最初对SIMR-SMR举行定向三向分解:脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,以证明MitoPunch工程细胞系的临床潜力。后果BJ-MSC比较、BJ ρ0+PBMC1-MSCs和BJ ρ0+HEK293T-MSCs都构成了这三种MSC分解谱系(图4F和S1W)。BJ比较组和SIMR克隆组的脂肪细胞和软骨细胞在表型上类似,而SIMR成骨细胞偏向于发生更多的钙堆积。因而本文的线粒体转移战略经过波动掺入特定的、有害的、非自然的供体mtDNAs,可以由ρ0成纤维细胞发生iPSCs、MSCs和进一步分解的细胞范例。



图4 SIMR iPSCs发生具有三细分解潜力的MSCs。(A)流式细胞术检测MSC生物标记物CD73、CD90和CD105,以及非MSCs生物标记物cocktail。有颜色为免疫染色样品,同型阴性比较用灰色表现。BJ-MSC比较的数据与图S5A数据相反。图示为自然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSCs代表性克隆。(B)明视野显微镜表现未处置的BJ-MSC和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11黏附到塑料上,20×缩小(比例尺100μm)。BJ-MSC比较数据与图S5B数据相反。(C)约1.5×104自然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11的OCR丈量值。BJ-MSC比较数据与图S5C相反。数据为3次技能反复的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test查验明显性。(D)自然BJ-MSCs以及BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2、11的1:1:1混淆的定量相位显微。BJ-MSC比较数据与图S5D相反。图为带有非常值的箱线图。数据辨别为77自然BJ-MSCs和172 BJ ρ0+PBMC1-MSCs的均值。Welch’s t test检测明显性。(E)辨别以T细胞:MSC = 1:2、1:1、5:1和10:1的比例,将T细胞参加到自然BJ-MSC或BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2或11培育物中。共培育5天后,流式细胞术和CFSE染料浓缩法测定T细胞增殖。“NS"(无安慰)标志表现没有CD3/CD28珠激活的T细胞。“-ve"(阴性)标志表现安慰的T细胞中没有添加MSCs。“+ve"(阳性)标志表现骨髓源性克制细胞与T细胞的比例为1:1。数据为3次技能反复的均匀值。(F)自然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11的三细分解。切片牢固并辨别用1 μM Bodipy 493/503、1%茜素红S和0.1%番红O染色。所示为脂肪细胞(diyi行,20×;比例尺100μm),骨细胞(第二行,20×;比例尺200μm)和软骨细胞(第四行,5×;比例尺500μm)。另见图S1。


05-SIMR细胞代谢及RNA转录物随细胞运气变化而改动


       利用超高效液相色谱-质谱(UPHLC-MS)对154种稳态代谢物举行定量,实验细胞包罗成纤维细胞、iPSC和MSC运气的自然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1克隆和BJ ρ0+HEK293T克隆。条理聚类表现了独立于线粒体转移形态的成纤维细胞、iPSCs和MSCs的差别分组特性(图S2A和S2B表S3)。代谢物数据的主身分剖析(PCA)也表现了代表成纤维细胞、iPSC和MSC运气的三个次要簇,但每个运气中SIMR和自然比较细胞间没有分明差别(图S2C和S2D)。BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆的代谢物组变异剖析(MSVA)和欧几里德间隔剖析表现,它们本身与各自的BJ-iPSC和BJ-MSC比较具有类似的代谢物途径状况(图S2A、S2E和S2F)。相比之下,BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆1和2与克隆4和BJ-iPSC比较有几个代谢途径有区别,分外是嘌呤、嘧啶、glutathione和乙醇代谢(图S2B、S2E和S2F)。在进一步分解为BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆后,BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆中的这种差别不再存在(图S2B、S2E和S2F)。总之,稳态代谢物剖析表现,SIMR细胞与自然比较细胞相称,仅有的多数差别在iPSC重编程并向MSCs分解时可以失掉办理。


       使用RNA测序(RNA-Seq)评价成纤维细胞、iPSC和MSC运气的SIMR细胞中的全转录组。DESeq2用于辨认明显差别表达的基因(DEGs),界说为改动倍数曲log2大于0.5,校正后p < 0.05的基因。关于BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR细胞,与自然BJ比较细胞相比,成纤维细胞运气时有zuida数目的DEGs,校正后p < 0.05(图5A和S3A)。将成纤维细胞、iPSC和MSC运气的BJ ρ0+PBMC1细胞辨别与自然BJ亲代细胞举行比力,RNA-seq辨别辨认出1741、194和224个降低的,1827、68和115个克制的DEGs(图5A;表S4)。对独立发生的BJ ρ0+HEK293T细胞举行转录组剖析,成纤维细胞、iPSC和MSC运气中与自然BJ亲代细胞相比,辨别有1,377、537和239降低,1,564、648和210克制的DEGs(图S3A表S4)。


       DEGs的反响途径富集剖析表现,与自然BJ成纤维细胞相比,SIMR成纤维细胞转录谱中的差别途径产生了改动,包罗与细胞外基质构造和补体级联相干的途径(图S3B表S5)。将一切SIMR-iPSC和SIMR-MSCs辨别与自然BJ-iPSC和BJ-MSC比较比力,举行差别表达和途径富集剖析,确定的DEGs数目明显较少,过多的途径次要由组卵白转录物簇驱动(图S3C和S3D表S5)。


       进一步细致的转录组剖析展现了基于细胞情况和运气的代谢途径差别。体细胞重编程为iPSCs必要代谢变化,从次要氧化磷酸化转为次要糖酵解,对应一切基因组变异剖析(GSVA)表现糖酵解相干转录物表达增长的BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK 293 IPSc克隆(图S4A和S4B)。别的GSVA表现,在BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR成纤维细胞中,ETC转录物的表达较自然BJ成纤维细胞中多(图S4A和S4B)。但是免疫印迹表现,琥珀酸脱氢酶(SDHB;复合体II)、泛醇-xibaosesu c复原酶中心卵白2(UUQCRC2;复合物Ⅲ)、细胞色素氧化酶Ⅱ(MT-COXII;复合体Ⅳ),和ATP合酶F1亚单元α(ATP5A;复合物V)后果相反,SIMR成纤维细胞中的ETC卵白较自然BJ成纤维细胞比较增加(图S4C)。总的来说,全转录组数据剖析表现,SIMR克隆和自然比较细胞在成纤维细胞运气上最后的宏大差别在重编程和分解历程中渐渐消散。


       检测了MitoCarta2.0数据库中列出的1,158个核基因的RNA转录程度,这些基因编码的卵白定位于线粒体。对来自这些基因的转录物的分级聚类剖析可在成纤维运气时将BJ ρ0+PBMC1、BJ ρ0+HEK293T和BJ ρ0转录物与自然BJ转录物分散出来(图5B和S3B)。两组间DEGs的途径剖析表现,自然BJ成纤维细胞中编码ETC卵白的基因富集(表S4)。值得留意的是,iPSC和MSC运气下没有察看到这种差别聚类(图5B和S5A)。


       进一步对mtDNA编码的转录物反省发明,与来自SIMR和自然成纤维细胞的转录物相比,BJ ρ0细胞中一切13种编码基因转录物的表达明显低落,相似(图5C和S5B)。别的与自然BJ成纤维细胞相比,BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T成纤维细胞13种mtDNA编码基因的表达均明显低落(图5C和S5B)。相比之下,在将SIMR和比较成纤维细胞重编程为iPSCs,然后分解为MSCs后,在mtDNA转录程度上没有察看到明显差别(图5C和S2B)。


       然后利用MitoXplorer管道量化已辨认的DEGs中38个差别线粒体历程的表现。正如呼吸作用消散所预期的那样,与自然BJ成纤维细胞相比,BJ ρ0成纤维细胞中展示出29个线粒体历程DEGs,分外是氧化磷酸化、线粒体基因组翻译和氨基酸代谢历程中(图5D)。相似地,与自然BJ成纤维细胞相比,BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T成纤维细胞辨别在30和29个线粒体历程中改动了基因表达谱(图5D和S1C)。利用MitoXplorer的进一步剖析突出了两个SIMR系之间的差别,由于与BJ ρ0+HEK293T成纤维细胞相比,BJ ρ0+PBMC1在mtDNA相干氧化磷酸化和线粒体基因组翻译方面的DEGs更少。别的与自然BJ成纤维细胞相比,两种SIMR成纤维细胞系中,与细胞核编码的线粒体翻译和钙信号通报相干的DEGs都比BJ ρ0系更多。值得留意的是,经过重编程,受影响的线粒体历程的数目明显增加,在BJ ρ0+PBMC1-iPSCs和BJ ρ0+HEK293T-iPSCs中辨别只要7个和16个历程表现DEG(图5D和S1C)。最初,BJ ρ0+PBMC1-MSCs和BJ ρ0+HEK293T-MSCs辨别只表现出3和8个带有DEGs的线粒体历程,在两个SIMR-MSCs系和MSCs比较之间只要ROS进攻相似地改动(图5D和S1C)。这些数据展现了在其他线粒体历程中,成纤维细胞运气中翻译的转录组改动,作为外源性mtDNA功效在SIMR细胞中的潜伏差别标志。综上所述,只管重编程及分解后,SIMR细胞线粒体功效变得与BJ比较组愈加类似,但基于转移的mtDNA序列的差别仍旧存在。



图5 SIMR和自然mtDNA细胞的转录组特性。(A)BJ ρ0+PBMC1细胞与自然BJ细胞在成纤维细胞、iPSC和MSC运气时的DEGs数量比力。(B)核编码MitoCarta2.0数据库基因的条理聚类,辨别来自成纤维细胞、iPSC和MSC运气的自然BJ、BJ ρ0和BJ ρ0+PBMC1细胞。(C)尺度化、批量校正后的read计数箱线图,辨别为成纤维细胞、iPSC和MSC运气的自然BJ、BJ ρ0和BJ ρ0+PBMC1细胞中,13个MitoCarta2.0正文的mtDNA编码基因。Welch’s t test查验明显性。(D)MitoXplorer归类后的DEGs,为BJ ρ0+PBMC1辨别与成纤维细胞、iPSC和MSC运气的自然BJ细胞相比,分为38个线粒体历程。另拜见图S2、S3、S4、S5以及表S3、S4和S5。


讨论

       本研讨利用MitoPunch开辟了一种疾速、通用的线粒体通报办法,可发生具有特定mtDNA-nDNA组合的转化或非永生细胞,绝对于cybrid技能有很大上风,cybird无法可控选择心理线粒体,或挑选具有所需mtDNA渐变的细胞较为耗时。本研讨标明,SIMR成纤维细胞的转录组和代谢组与ρ0受体细胞相似,而且重编程为多能性及随后的分解可将其重置为十分相似于未处置的比较细胞。利用其他线粒体转移办法,如不克不及重新编程的永生细胞系,将无法或很难完成本研讨。固然经过纳米刀片和显微注射也可以发生SIMR细胞,但这些低通量也存在范围性。相比之下MitoPunch可以在2周内发生少量含希冀的、波动的mtDNA-nDNA组合的克隆。


       制备用于ρ0受体成纤维细胞研讨的SIMR克隆已完成。一些mtDNA-nDNA组合发生SIMR克隆的服从较低,只能用MitoPunch这种高通量平台来检测。比拟143BTK-ρ0+HEK293T SIMR细胞发生约75个克隆,MitoPunch转移到原代成纤维细胞发生的SIMR克隆较少,大概与Hayflick极限或对MitoPunch步伐的次优反响有关。如ADF ρ0受体生长最慢,在mtDNA耗尽后不久到达朽迈(数据未表现),招致最少的SIMR克隆。均匀而言,与BJ ρ0+PBMC1克隆相比,取得的BJ ρ0+HEK293T克隆为2倍左右,这大概与mtDNA-nDNA对相容性和代谢状况有关。SIMR成纤维细胞的重编程服从较自然成纤维比较组也低落了10倍。在非自然mtDNA小鼠胚胎成纤维细胞重编程中察看到了相似的增加,大概是由于mtDNA-nDNA相容性较低。


       经过转录组数据察看到SIMR成纤维细胞中mtDNA-nDNA夹杂作用不*,表现SIMR成纤维细胞和未被利用的成纤维细胞之间无数百个DEGs。别的,只管SIMR细胞在限定性培育基中培育必要ETC活性才干生长和存活,但SIMR和ρ0成纤维细胞的MitoCarta2.0和mtDNA编码的转录物最类似。这些数据标明,SIMR成纤维细胞中的外源性mtDNA不克不及*相同和影响nDNA,只管可以支持选择性程度的ETC活性和细胞增殖代谢物的充实分解。支持这一看法的证据包罗ddC表露发生的nDNA毁伤最小,SIMR成纤维细胞的代谢组和转录组谱在SIMR-iPSCs中大多被重置为未处置的BJ-iPSC谱。本文后果与一份陈诉分歧,有陈诉称ρ0细胞的推陈出新[tuī chén chū xīn]和表观基因组曾经产生改动,构成胞质杂合体只能局部重置,本文后果与此分歧。本文为研讨波动mtDNA移植及细胞运气改动后ρ0细胞转录和代谢的重置提供了一个平台。经过其他情势的线粒体转移承受外源mtDNA的细胞中,mtDNA转录谱能否也被扰乱必要进一步研讨验证。


       总之,本研讨提供了一个原感性的线粒体转移途径,可以发生具有特定mtDNA-nDNA组合的差别运气的细胞,包罗具有天然界中没有的基因组配对的克隆系。将来的研讨将发生代表高能量需求构造的SIMR衍生细胞,如心肌细胞或神经元,以及现在无法发生的含有渐变mtDNA的SIMR-iPSCs,以使mtDNA病患者特异性疾病和具有等基因核的药物挑选模子成为大概。别的本研讨后果标明,线粒体转移实行的表明必需思索到最后发生的细胞大概不表现*的mtDNA-nDNA整合及随后的细胞途径规复。这关于缺乏后续重编程潜力的细胞,如瞬时或转化的线粒体转移细胞系来说尤其明显,由于研讨后果标明重编程和分解是重置nDNA表达谱所必须的。最初,本文的线粒体转移途径绕过了细胞中mtDNA和nDNAs的退化成对选择,扩展了人类群体中存在的基因组组合库,并发生了具有确定的mtDNA-nDNA组合和dute功效特征的差别运气的细胞库,用于研讨和潜伏的医治使用。


参考文献

Patananan,  A. N. , et al. "Pressure-Driven Mitochondrial Transfer Pipeline  Generates Mammalian Cells of Desired Genetic Combinations and Fates."  Cell Reports 33.13(2020):108562.


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