ag真人登录--欢迎您

接待离开北京心动ag真人信息技能有限公司网站!
技能文章您如今的地位:首页 > 技能文章 > BAG3朋友复合物——维持卵白毒性应激时期的心肌细胞功效

BAG3朋友复合物——维持卵白毒性应激时期的心肌细胞功效

公布>###nbsp; 点击次数:180次

       分子朋友可以调治人类卵白质组的质量控制,此中触及很多疾病,包罗心力弱竭。BAG3基因(编码共朋友卵白)的渐变与遗传性和分发性扩张型心肌病惹起的心力弱竭有关。家属性BAG3渐变是常染色体显性的,常常招致编码序列的截短,引发杂合子功效丢失机制。但是BAG3基因杂合子敲除鼠并没有体现出可检测的疾病表型。为了在人类体系中创建BAG3心肌病模子,美国研讨职员Luke M. Judge等使用人类诱导多无能细胞(iPSCs)发生了一系列BAG3功效缺失渐变的心肌细胞(iPS-CMs)。BAG3渐变杂合子低落了iPS-CMs的卵白质表达,毁坏了肌原纤维布局,侵害了紧缩功效。当表露于已知会惹起心脏毒性的卵白酶体克制剂时,BAG3缺陷的iPS-CMs对进一步的肌原纤维断裂和紧缩功效停滞分外敏感。对内源性BAG3卵白举行亲和标志和质谱卵白质组学,进一步确定了人类心脏中BAG3和谐的心脏掩护朋友复合物。最初基于这些后果创建了一个模子,用于评价民气肌细胞中的卵白质质量控制途径及其作为心脏药物毒性的医治靶点和易感要素的潜力。研讨效果以“A BAG3 chaperone complex maintains cardiomyocyte function duringproteotoxic stress"为题宣布于JCI insight


配景


       人的终身中心肌细胞必需坚持有恒定的紧缩功效,因而细胞会履历一连的机器和氧化应激,而这会引发卵白质毁伤和错误折叠,大概侵害紧缩功效,并招致有毒肽的构成和收集。已知心脏简直没有什么再生才能,因而心肌细胞必需严厉地调治新卵白质分解、降解受损卵白质身分,以赔偿这种卵白毒性应激。为此,心脏构造坚持了高程度的构成型和构造特异xing朋友卵白,稀有的朋友卵白渐变大概会招致严峻的疾病。


       卵白质量控制途径在遗传性和分发性心脏病中饰演紧张脚色,也是潜伏的医治靶点。帮助朋友卵白BAG3是一个值得存眷的分子,由于遗传证据标明BAG3变体既youbing感性的,也有掩护性的。如稀有的P209L错义渐变会招致严峻的肌原纤维肌病,这是一种儿童期发病、会影响骨骼肌和心肌的致命疾病,BAG3卵白大概会增长其功效毒性。别的BAG3有多种杂合渐变,此中很多是与功效丢失分歧的无义或移码渐变,招致常染色体显性家属性扩张型心肌病。BAG3还与取得性心肌病有关,如应激性(Takotsubo)心肌病。而BAG3中的一个罕见编码多态性,又与特发性扩张型心肌病产生的明显低落相干,标明该多态性大概具有掩护作用。植物模子中,通常使用BAG3渐变或缺失制造肌病表型。但是在小鼠中敲除BAG3基因发生的后果纷歧致:一组呈原发性肌病表型,另一组则是没有明白肌肉表型的满身性病理,但两组中的杂合子缺失小鼠都没有检测就任何表型。由于BAG3相干的人类心脏疾病每每与杂合子功效缺失渐变有关,因而小鼠大概无法作为该疾病的抱负模子。

  

       BAG3是由热休克因子1诱导的应激反响基因。固然BAG3在很多构造中普遍表达,但它在骨骼肌和心肌中表达zuigao,并定位于肌节Z线。作为一种帮助朋友,BAG3卵白调治ATP周转以及HS70(构成型)和HSP70(诱导型)的卵白质折叠活性。它还在物理和功效上与一个独自的朋友卵白家属——小热休克卵白(HSPB)互相作用,并充任毗连HSP70与HSPB家属功效的支架。在人类细胞中,BAG 3-HSP70-HSPB复合物经过卵白酶体和自噬途径调治泛素化卵白降解。但是实行性研讨是经过过表达和/或瞬时敲除手腕,在具有不确定心理相干性的永生化细胞系中举行的,鉴于人BAG3渐变惹起的心脏特异性的病理,以及靶构造中卵白质的dute表达形式,假如能在心肌细胞中举行疾病建模,将是zuiyou用的。别的为制止因办法发生的虚伪互相作用,利用内源基由于一个优选办法。为评价BAG3在民气肌细胞心理和病理功效中的作用,研讨职员还使用基因工程构建的人诱导多无能细胞(iPSCs)发生了一系列同基因的心肌细胞,以更正确地归纳综合民气肌病的各个方面,以及掩护心脏免受应激的机制。


后果


01-BAG3渐变型iPS-CMs

       在iPSCs的细胞质中检测到BAG3卵白,在iPSC源的心肌细胞(iPS-CMs)中,BAG3增长了约10倍,并在肌节Z线和细胞核周区富集。起首研讨BAG3缺陷对心肌细胞的影响,使用基因工程改革内源性BAG3基因座发生功效缺失渐变,以模仿晚期无义渐变的影响,在BAG3基因的两个差别位点发生了渐变(图1)。转录激活因子样效应因子核酸酶(TALENs)分散出具有功效缺失渐变的杂合和纯合克隆,并以第二外显子的两个差别局部为目的,利用以(CRISPR)/Cas9为底子的战略举行了聚类(图1)。测序验证每个工程渐变系的基因型。后果证明一切基因修饰的iPSC系都保存了多能性生长和形状、正常核型、表达多能性标志,并能无效地分解为心肌细胞。


       正如展望的那样,BAG3功效缺失渐变使BAG3卵白表达增加(图1)。渐变心肌细胞坚持分解30天以上,细胞生机、形状或跳动没有分明非常,与出生时心脏形状正常的BAG3基因敲除鼠模子分歧。依据人类临床陈诉和植物研讨,假定BAG3渐变细胞会随着工夫的推移引发肌丝布局断裂,分外是在肌节Z线地位。为反省肌丝布局,将心肌细胞放在玻片上培育并以差别的工夫距离察看,随后牢固并染色肌节Z线卵白α-actin(ACTN 2)。研讨发明,心肌细胞放到玻片上会持续跳动,但7天或更永劫间后,BAG3-/-心肌细胞的Z线布局产生了严峻破坏(图1)。利用5分制评分法对细胞肌节混乱水平举行评分。与野生(WT)型细胞相比,BAG3渐变细胞中肌丝产生明显混乱的比例增长,BAG3-/-细胞表现出比BAG3+/-细胞更严峻的表型趋向。在差别靶向战略发生的品系之间察看后果分歧,标明该表型是由BAG3表达而不是靶外效应惹起的。



图1 基因组工程构建的BAG3同基因渐变使iPS-CMs中肌节杂乱。(A)BAG3基因表示图。(B)iPS-CMs中BAG3卵白的卵白质印迹。(C)免疫荧光染色和流式细胞术,抗体靶向iPS-CMs中的BAG3。(D)BAG3-/-型iPS-CMs组与WT比较组的病理学比力。(E)5分制评重量化肌节混乱。


02-心理相干条件下iPS-CMs的紧缩功效

       关于在尺度构造培育外表上培育的心肌细胞,通常其表现出的形状外形和肌原纤维分列与正常构造中差别。为评价更多心理相干条件下的心肌细胞紧缩功效,选择在有特定的多少外形的微图案化外表上,利用差别硬度的聚丙烯酰胺基质培育心肌细胞,经过Plexithermo公司的HCells高通量的单细胞测试平台丈量差别机器条件下的紧缩功效。将心肌细胞接种到长宽比为7:1的矩形模子上,基质硬度仿照心理性(10 kPa)或病感性增长的(35 kPa)心肌硬度。过丈量基质中嵌入的荧光珠的位移来盘算单个细胞的紧缩力。当在模仿心理硬度的基质上培育时,BAG3+/–和BAG3-/-心肌细胞的紧缩力比WT心肌细胞小(图2)。为评价肌原纤维布局并丈量肌节延长,利用LifeAct标志办法,发明与WT心肌细胞相比,BAG3+/–和BAG3 -/-心肌细胞都表现出肌节延长缺陷(图2)。在模仿病理(35 kPa)基质上的反复实行发明,硬度变大也会招致全体紧缩才能削弱以及肌节延长。因而,BAG3功效的局部丢失侵害了民气肌细胞的紧缩功能,会肌原纤维布局和活性的毁坏,体现出扩张型心肌病表型。



图2 在微图案化基质上培育的iPS-CMs中,BAG3渐变发生紧缩缺陷。(A)紧缩才能是依据丈量的力和紧缩速率盘算的,紧缩速率经过显微测定基质中荧光珠的活动发生的牵引力取得。(B)在LifeAct标志的肌原纤维中丈量肌节延长。(C)图案化的LifeAct标志细胞图像和相干的外表牵引应力热图。


03-BAG3避免卵白酶体克制剂引发的心脏毒性


       已知BAG3经过卵白酶体或自噬途径到场靶向的泛素化卵白降解。因而可以假定,卵白酶体克制剂会对BAG3共朋友活性有缺陷的心肌细胞形成进一步侵害。卵白酶体克制剂是用于癌症医治的一类紧张化合物,但对植物和人有肯定心脏毒性。录像研讨发明,卵白酶体克制剂bortezomib(bortezomib)和carfilzomib(carfilzomib)处置后,iPS-CMs紧缩力呈剂量依赖性低落。而发生这种效应的药物浓度恰好在所报道的患者静脉输注后的血浆药物浓度范畴内。撤除卵白酶体克制剂后,紧缩力仍持续降落,但几天后规复(zuigao剂量除外)。值得留意的是,bortezomib对紧缩力的作用比carfilzomib更强、更耐久。

用异样的办法比力了bortezomib对WT型和BAG3渐变型心肌细胞的影响。与WT比较组相比,0.1 μMbortezomib使BAG3渐变型iPS-CMs紧缩力明显低落(图3)。以相反浓度和继续工夫用bortezomib处置心理硬度基质上培育的心肌细胞发明,与WT型相比,BAG3渐变型心肌细胞受bortezomib影响更大,紧缩力降落更多,而且未能规复紧缩活性(图3)。



图3 BAG3是避免卵白酶体克制剂bortezomib引发的严峻心脏毒性所需的。(A)主动拍照显微镜体系(Cellogy Pulse),用于一连丈量bortezomib(0.1μM)处置前和处置后每24h,iPS-CMs的紧缩才能。(B)将在模仿心理硬度(10kPa)基质上培育的WT型和BAG3渐变型iPS-CMs表露于bortezomib(0.1 μM)48h,然后在RPMI/B27培育基中规复3天丈量各个个工夫点的紧缩力(C,D)用表达荧光交融卵白ACTN2-mKate2的质粒转染iPS-CMs,标志Z线。经过延时显微镜对单个细胞举行基线成像,在DMSO(0.01%)或bortezomib(0.1 μM)处置后每24h成像。(E)利用5分制体系在每个工夫点对单个细胞举行评分。

为确定由bortezomib惹起的紧缩才能降落能否源于肌丝布局毁坏,表达了一种荧光标志的ACTN2来标志活细胞中的Z线。表达转基因的细胞正常存活,并持续正常紧缩。延时荧灯光显示微发明bortezomib处置48h内,肌原纤维布局呈现缺陷(图3C–E)。5分制评分体系量化中肌原纤维混乱水平,可见bortezomib处置后,BAG3+/–和BAG3-/-心肌细胞表现出比WT心肌细胞更严峻的肌丝布局毁坏(图3E)。这些后果支持了BAG3渐变体不克不及赔偿卵白酶体毁伤诱导的卵白毒性应激。

用WT型、BAG3渐变型和MYBPC3渐变型iPS-CMs举行了剂量反响剖析,以反省bortezomib和carfilzomib对紧缩性和生活力的影响(图4)。已知心肌疾病中常常会呈现心肌肌球卵白联合卵白C(MYBPC3)渐变,并大概与BAG3朋友复合物有互相作用。研讨发明,与WT细胞相比,BAG3+/–和BAG3-/-细胞中bortezomib和carfilzomib克制紧缩的EC50明显低落,而MYBPC 3+/–细胞中EC50没有低落(图4)。研讨以为这些对紧缩性的影响并不但纯是细胞殒命形成的,由于bortezomib仅在BAG3-/-细胞中对细胞生机有明显影响,而carfilzomib在到达克制紧缩性的剂量下对细胞生机的影响十分小。为进一步证明药物毒性的特异性,埋头脏毒性hualiao药物ameisu反复了这些实验,没有发明BAG3渐变心肌细胞毒性增长的证据(图4)。最初,关于每种药物,WT型细胞中的EC50与患者静脉输注后陈诉的峰值血浆浓度十分靠近,证明该剖析在临床相干剂量下是敏感的。



图4 BAG3和卵白酶体克制剂之间互相作用的基因和药理学特异性。WT型、BAG3渐变型和MyBPC 3渐变型iPS-CMs用(A)bortezomib、(B)carfilzomib、(C)ameisu以zhiding剂量处置。在药物处置前和处置后48h丈量紧缩峰值高度。下图为利用非线性回归剖析从每个响应的剂量反响曲线盘算的EC50和95%相信区间。

04-BAG3敲除对朋友卵白的影响

假定BAG3基因敲除,会对到场和谐应激反响的特定BAG3互相作用朋友的表达有影响。而研讨发明敲除BAG3会招致HSPB8卵白程度低落,但其他朋友不受影响(图5A-C)。与在永生化细胞系中的发明分歧,用bortezomib处置会明显诱导BAG3和HSP70卵白程度增长(图5A和B)。MG132和carfilzomib也有相似结果。已知在报道的与BAG3互相作用的心脏富集型小热休克卵白(HSPB5-8)中,只要HSPB6和HSPB8在WT细胞中是由卵白酶体克制诱导的(图5A和B)。别的bortezomib处置后,CRYAB(HSPB5)卵白在BAG3-/-细胞中特异性积聚(图5A和C)。

后果标明HSPB8是心肌细胞BAG3功效的一个分外紧张的同伴。有研讨陈诉称,激活自噬降解卵白毒性肽必要BAG3和HSPB8。因而假定BAG3表达丢失的同时卵白酶体克制,将侵害心肌细胞调治自噬的才能,而自噬控制泛素化卵白质的赔偿性降解。为丈量自噬通量,利用卵白质印迹法监测巴非霉素A1(克制自噬降解)对LC3卵白程度的影响。发明巴非霉素A1处置后,LC3-II疾速降解增长了4-6倍,与心肌细胞中活泼的自噬通量分歧(图5D和E)。分外利用bortezomib处置使LC3-II程度明显增长,与自噬的赔偿性诱导分歧(图5D和E)。但是BAG3敲除的杂合或纯合体在任何条件下都不会明显改动LC3-II的程度。别的在WT和BAG3缺陷型心肌细胞中,bortezomib处置后泛素化卵白的积聚是相反的(图5D)。这些发明标明在民气肌细胞卵白酶体克制引发的少量自噬通量应对中,BAG3并不是调治该应对所必须的,但并不扫除BAG3大概靶向此中的客户卵白。



图5 bortezomib诱导心脏朋友应激反响并增长自噬流量,后者不必要BAG3。(A)iPS-CMs用载体比较或1μMbortezomib处置20h,然后提卵白举行WB。(B和C)条带强度依据GAPDH量化,并依据载体处置比较尺度化。B为辨别用载体和bortezomib处置的WT心肌细胞,C为辨别用载体和bortezomib处置的BAG3-/-心肌细胞。(D)iPS-CMs辨别用DMSO、100 nM巴非霉素A1(BafA1)处置6h,或1μMbortezomib处置14h后100 nM巴非霉素A1处置6h。提取总卵白,抗LC3A/B抗体举行WB。(E)LC3-II带强度依据GAPDH量化,依据比较样品尺度化。

05-与BAG3卵白互相作用的心脏特异性身分

为确定BAG3朋友复合物的心脏特异性身分和/或客户卵白,举行了AP-MS。利用基因组工程将一个C末了3×FLAG亲和标签敲入两个等位基因的内源性BAG3位点。当用HSP70举行体外剖析以评价核苷酸互换因子活性和客户卵白开释时,N端和C端BAG3-FLAG与WT BAG3间没有差别。bortezomib处置WT和BAG3-FLAG iPS-CMs,发明表露48h后紧缩力没有差别。AP-MS剖析发明,在iPS-CMs中共判定出46种与内源性BAG3-FLAG的高相信度互相作用(图6)。朋友卵白和相干卵白质组成了此中zuida的一组互相作用因子,支持了前文假定即BAG3调治心脏中的卵白质质量控制途径。互相作用网络没有察看就任何与自噬间接相干的卵白质,与BAG3在调治LC3通量方面缺乏作用分歧。从未分解的iPSCs和iPS-CMs中判定的互相作用因子中,广泛表达的朋友卵白及其相干卵白大局部重叠。仅从具有内源性BAG3标签的心肌细胞中判定出分外的朋友相干卵白,包罗HSPB8和CRYAB,而心肌细胞中表达的其他小热休克卵白则不存在,包罗HSPB6和HSPB7。别的一些核糖体和其他RNA联合卵白也被判定为心脏特异性的BAG3复合物的一局部,这大概代表了卵白质质量控制的一个未被充实了解的方面。其他判定出的互相作用因子是种种细胞质、肌节、细胞核和排泄卵白,它们大概是BAG3朋友复合物的靶标,大概它们表示了与其他细胞功效的联系。



图6 心脏特异性BAG3卵白互相作用网络。在具有内源性BAG3-3×FLAG标志的iPS-CMs中,经过AP-MS判定出的一切46个互相作用因子按功效种别分组。白色圆圈表现也从未分解的iPSCs中判定出的互相作用因子,白色圆圈仅从iPS-CMs中判定出的。

结论

本研讨创建的细胞模子容许在单个同基因配景下间接比力差别的渐变,模仿BAG3功效遗传丧失发明杂合BAG3渐变招致BAG3卵白增加约50%,并在人类心肌细胞中发生人类疾病表型。一些实验中BAG3功效局部和*丢失异样侵害心肌细胞的心理功效,标明严厉调治BAG3表达程度的紧张性。卵白酶体克制剂bortezomibcarfilzomib处置后,即便BAG3功效局部丢失也会招致紧缩功效和肌丝完备性的严峻失代偿,证明了BAG3共朋友功效可避免卵白毒性应激。

本研讨还使用AP-MS判定了HSP70和小HSP家属中,与心肌细胞BAG3互相作用的特定卵白质。证明白内源性表位标签可以协助在感兴味的细胞范例的心理表达程度上研讨卵白质互相作用。并经过这种办法判定了几种潜伏的新型BAG3互相作用卵白,包罗渐变会招致包容体肌病的VCP、常渐变于肥厚型和扩张型心肌病中的MYBPC3,此中MYBPC3是weiyi与BAG3复合物联合的肌节卵白,标明它大概是一种紧张的客户卵白。其他卵白标明BAG3大概在调治卵白质组中发扬分外功效,如在核糖体翻译程度上。将来对这些途径的基因和功效研讨大概会协助展现心力弱竭的机制、药物毒性的遗传易理性,推进新医治战略的开辟。


参考文献:

Luke, et al. "A BAG3 chaperone complex maintains cardiomyocyte function during proteotoxic stress." JCI Insight 2.14(2017).




高通量单细胞功效检测体系

在以上研讨中,触及了一种高通量的单细胞测试平台,它可以对多个hPSC-CMs单细胞举行成像与力学测试。现为各人介绍Plexithermo公司的HCells高通量单细胞功效检测体系(HCells-1根本型,HCells-1F离子丈量型)。作为一种非毁坏性,非侵入性的细胞检测平台,它可以对多个细胞举行疾速成像,同时可失掉细胞的紧缩力、钙瞬变、紧缩速率、细胞巨细、面积、实践功率,紧缩角度、速率差和力差等少量数据。所搭载的纳米水凝胶的可调控基底硬度,对培育的心肌细胞举行催熟并促进分解以顺应差别的研讨需求。别的,该平台支持微观标准下的功效检测,包罗种种构造、斑马鱼模子等,使用远景非常宽广。




在线客服
德律风征询 ###
在线客服