• ag真人登录--欢迎您

    接待离开北京心动ag真人信息技能有限公司网站!
    技能文章您如今的地位:首页 > 技能文章 > 心理形状和基质硬度可进步人多无能细胞分解的心肌细胞的紧缩才能与成熟度

    心理形状和基质硬度可进步人多无能细胞分解的心肌细胞的紧缩才能与成熟度

    公布>###nbsp; 点击次数:144次

           心脏作为人体的紧张器官,心肌紧缩才能对其功效至关紧张。心肌细胞(CMs)的紧缩运动中缀大概招致种种心脏疾病,同时,以人工手腕改动心肌紧缩才能也是医治各种心脏疾病的常用办法。经过人多无能细胞分解而来的心肌细胞(hPSC-CMs),由于其易于培育且存活工夫长,非常合适作为心肌细胞体外心理模子。但是,未经处置的hPSC-CMs肌原纤维分列杂乱,这限定了它们的紧缩才能,即对成熟CMs的模仿才能。


           明天,与各人分享一篇宣布在PNAS(IF=15.7)上的文章“Contractilityof  single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells  depends onphysiological shape and substrate  stiffness",作者经过设置差别心理形状与基质硬度改进了hPSC-CMs的紧缩才能,减小与成熟CMs之间的差别,并深化研讨了促使hPSC-CMs成熟和影响肌节功效的内涵要素。



    图1 差别横纵比hPSC-CMs的Lifeact标志肌动卵白成像


           在10 kPa(心肌细胞正常基质硬度)聚丙烯酰胺水凝胶中培育横纵比为1:1、3:1、5:1、7:1的矩形hPSC-CMs,并坚持其总面积为2000 μm2。经Lifeact染色后可明晰的看到肌动卵白(F-actin)在高横纵比的细胞中有序分列,且随着长径比的增长,分列越规整,这将有助于进步hPSC-CMs的紧缩性及机器功率。



    图2 牵引力显微镜计算zuida牵引力空间散布图3:1、5:1、7:1、平凡hPSC-CMs和1:1 hPSC-CMs (左),差别横纵比hPSC-CMs Σ|Fc|的变革图(右)


           牵引力显微镜盘算所得的基质牵引力数据表现横纵比为7:1的细胞紧缩力(Σ|Fc|)zuiqiang,且均匀紧缩速率与其他hPSC-CMs坚持分歧,即可知此时hPSC-CMs的机器功率的差别次要表现在紧缩力上,二者成反比。随着横纵比增大,hPSC-CMs紧缩的zuida速率有所增长,标明定形处置有助于进步机器功率与紧缩性。在2000  μm2的未定型hPSC-CMs中,其紧缩力与1:1的hPSC-CMs类似,而肌原纤维的不规矩散布则使其紧缩力仍旧小于3:1的hPSC-CMs。



    图3  Lifeact标志肌原纤维线扫描成像(左),每μm肌节的均匀紧缩力(中),肌原纤维轴向活动比例(右)


           别的,颠末对细胞紧缩与舒张长度的丈量,横纵比与肌节紧缩的水平成正相干。经过粒子示踪测速法追踪F-actin,量化hPSC-CMs在主轴X与副轴Y上的活动状况[u(x)/v(y)]。后果表现,高横纵比的细胞在主轴偏向紧缩才能zuiqiang,这归因于肌原纤维的大范畴有序分列使得肌节延长,zuida限制地增长了hPSC-CMs的机器输入。轴向高度有序的肌原纤维分列也是CMs成熟的一个标记,此时hPSC-CMs可更好的对CMs举行模仿。



    图4 差别细胞形状与基质硬度下紧缩力比拟(左),6 kPa下hPSC-CMs 肌原纤维弯曲(中),35 kPa下肌原纤维局部断裂(右)


           之后,作者又制备了模仿胚胎心肌(6 kPa)和纤维化心肌(35 kPa)的水凝胶用以研讨差别硬度基质下hPSC-CMs的紧缩状况。如图所示,35   kPa下细胞的紧缩力zuidi仅为前二者的10%。一样平常状况下,细胞膜张力随横纵比的增长而增大,而胞内张力随基质硬度增长而增长。此时由于高基质硬度形成了胞内张力凌驾阈值,少量肌原纤维产生断裂(25%),类似的,在6   kPa下,低张力可使肌原纤维发生松懈与弯曲。为了证明张力阈值的存在,经过手动拉伸水凝胶提拔细胞膜张力,在拉伸5-10%时细胞力加强约10%,到达14%时肌原纤维开端断裂,之后细胞中止紧缩或紧缩力急剧降落。同时,在35  kPa下培育的hPSC-CMs随着胞外钙离子(安慰细胞紧缩)浓度的增长,肌原纤维断裂率分明上升,标明高硬度克制了细胞紧缩性,不然将会有更多肌原纤维断裂(>50%)。



    图5 EDTA、诺考达唑、ML-7和BDM处置后hPSC-CMs的变革状况(A),对应处置后细胞长度变革(B),肌联卵白(titin N2A, N2B)与肌钙卵白(TnI, 替恩替)在差别条件下(patterned, glass, 10kPa, 35kPa)的表达状况(下侧)


           为了研讨胞内张力对肌原纤维的有序分列能否有影响,利用EDTA培育hPSC-CMs以消弭其胞内张力,发明肌原纤维的松懈和肌节周期性构造会随着培育工夫的延伸而渐渐松懈和消散。之后,使用诺考达唑或细胞松懈素D(克制肌球卵白)克制细胞骨架聚合,或经过其他小分子再次消弭胞内张力(ATP酶克制剂克制非肌肉肌球卵白II型与肌动卵白的联合,ML-7克制非肌肉肌球卵白轻链激酶,或BDM克制非肌肉肌球卵白的ATM酶)。后果表现只要诺考达唑处置后的hPSC-CMs外部肌原纤维重新有序分列,标明肌球卵白与肌动卵白在肌原纤维的有序分列中起到了紧张的作用。尔后,又测定了肌联卵白(titin N2A, N2B)与肌钙卵白(TnI, )在差别条件下(能否颠末塑形、基底的品种与硬度)的表达状况,后果标明基质硬度和细胞形状可经过调治肌节张力的机制协同调治hPSC-CMs的紧缩性。



    图6 7:1和未塑形hPSC-CMs的钙离子瞬变图及线粒体散布图(上侧),电心理测试,定量(q)RT-PCR 测试及暗场横断管成像(下侧)


           别的,随着肌节活性的进步,hPSC-CMs的成熟度也进一步的改进。钙瞬变、线粒体的散布、电心理学特征和横断管的构成等都可以表现hPSC-CMs的成熟状况。如图所示,在7:1的hPSC-CMs中,钙离子随着细胞的紧缩而发生轴向挪动,而线粒体次要散布于细胞核四周及细胞两头,在电心理测试中,膜片钳记载处置后的hPSC-CMs具有更低的静息膜电位、更高的举措电位振幅和更高的zuida上升速率,同时,还可以在hPSC-CMs外表找到沿细胞膜散布的横断管布局,这些特性都标明hPSC-CMs与正常的民气肌细胞非常相近。再次表现了其作为体外心理模子的上风。不外,对单细胞举行的定量(q)RT-PCR后果标明,在基因表达的层面,能否颠末pattern处置的hPSC-CMs并未发生分明的区别。


    总结

           本研讨标明,在hPSC-CMs中,可以经过调治心理形状和基质硬度来影响细胞张力(调治紧缩力,创建和维持肌原纤维分列),使得肌节延长并转化为更高的机器输入。横纵比为7:1的hPSC-CMs的肌节活性zuigao且肌原纤维分列zuiwei规整,而紧缩才能的加强也标明其愈加靠近成熟的CMs。同时,经处置后的hPSC-CMs在电心理特征、钙瞬变、线粒体散布和横断管布局的存在与成熟的CMs更为类似。这进一步提拔了patterned-hPSC-CMs在体外心脏安康和疾病模子研讨中的潜力。


    参考文献:

    Ribeiro  A J S , Ang Y S , Fu J D , et al. Contractility of single  cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on  physiological shape and substrate stiffness[J]. Proceedings of the  National Academy of ences of the United States of America, 2015,  112(41).


    在线客服
    德律风征询 ###
    在线客服