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Nature:胞外基质卵白Agrin促进小鼠心脏再生

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       心脏病还是quanshijie范畴内殒命的次要缘故原由。当蒙受心脏疾病时,心肌细胞(CMs)会被瘀痕构造交换,瘀痕构造不克不及完成紧缩,因而不克不及到场泵血,招致剩余安康心肌构造压力增大,终极招致心力弱竭。在高等脊椎植物如蝾螈和斑马鱼中,心肌细胞可以高效的再生受损心脏。但,在哺乳植物中,有丝破裂后的成熟心肌细胞对受损构造的修复才能有限,再生和修复毁伤才能只能继续到出生的时分,今后,这种才能便会yongjiu消散。风趣的是,在复活小鼠中,心肌细胞增殖在出生一周之内足以修复心脏毁伤,这一周的工夫可以给迷信家提供一个工夫窗口来探求促进心脏再生的线索。


       明天,与各人分享一篇2017年由以色列威兹曼迷信研讨院的Eldad Tahzor 传授宣布在Nature(IF=40.137)上的文章《The extracellular matrix protein Agrin promotes heart regenerationin mice》,作者发明复活小鼠心脏中的收集卵白(Agrin)好像可以控制心肌细胞的再生历程。当将其注射到蒙受心脏病发作的成年小鼠心脏中时,Agrin可以开启心肌细胞再生功效,修复受损心肌细胞。



图1 小鼠心脏ECM介导的CMs增殖中Agrin的挑选判定


       起首,为了研讨细胞外基质(ECM)在心脏再生中的作用,作者选取复活小鼠(P1)和一周大(P7)的小鼠的ECM展开实行:将ECM中的细胞去除,仅留下基质,将其辨别参加到体外培育的心肌细胞中,对心肌细胞Ki67目标举行检测。得出复活小鼠的ECM更容易使心肌细胞增殖(图1  a-d),且以MMP依赖的方法举行诱导(图1  e-h)。经过质谱办法确定复活小鼠(P1)和一周大(P7)的小鼠的ECM中次要区别身分为Agrin,这种物质促进心肌细胞增殖。经过RNA、Western  blot和免疫荧光剖析进一步验证了复活小鼠(P1)ECM中Agrin含量更高(图1  i-k)。别的,还经过实行证明白Agrin可以在体外促进CM增殖(图1l)。



图2 Agrin延缓复活小鼠CMs成熟,是复活小鼠手术切除后心脏再生所必须的


       经过杂比武段,构建Agrin基因缺失的小鼠cKO(图2a)。对Agrin-cKO小鼠心脏中Agrin卵白和mRNA表达的剖析证明了等位基因被无效地删除(图2b-d)。Agrin-cKO-CMs的肌节布局体现出更成熟的形态,肌节α-肌动卵白和T-小管标志物定位结果加强(图2e)。异样,在Agrin-cKO心脏中,经过western  blot(图2f)和线粒体标志物Tom20(图2g)染色对Myh6/Myh7比率的量化明显进步。P1  Agrin-cKO心脏切片表现横纹肌节染色增长,CMs细胞周期活性低落(图2h,i)。这些征象标明,Agrin在复活小鼠期会起到克制CM成熟的作用(图2e-g)


       最初,检测Agrin-cKO小鼠心脏再生能否受损。P1小鼠承受心脏切除术,并在1周和4周落伍行评价(扩展数据图5i)。接纳Masson三色染色的构造学反省表现,绝对于野生型小鼠,Agrin-cKO小鼠的纤维化水平降低(图2j-l),与心功效低落分歧(图2m,n)。响应地,在Agrin-cKO心脏,CMs增殖增加(图2o,p)。综上所述,这些后果标明Agrin关于复活小鼠心脏再生是须要的,但关于出生后心脏的生长和维持并不是严厉要求的。



图3 Agrin诱导成年小鼠心脏再生


       接着研讨了重组Agrin能否能促进成年小鼠CMs的增殖和心脏再生(图3)。单次向心肌内注射Agrin(50μL,20μg/mL),PBS作为比较。Agrin处置可诱导临近于幼年心脏和成年心脏梗去世区安康心肌中的CMs重新进入细胞周期(图3a-c)。心肌梗身后4天的成年小鼠心脏构造学剖析表现,两组受损地区类似,但从第14天开端,Agrin处置心脏瘢痕构造面积增加,到第35天明显增加(图3d、e)。别的,Agrin处置可以改进心肌梗身后的心功效,这两种模子的超声心动图都很分明(图3f、g)。与比较组相比,Agrin处置的小鼠还体现出壁厚的保存和对扩张型心肌病的掩护作用(图3h)。



图4 Agrin经过Dag1、ERK和Yap信号转导促进CM增殖


       Dag1在P1心脏中普遍表达,但是到P8,其mRNA和卵白质的表达jinxian于CMs(图4a-c)。Agrin处置后在P7心肌细胞培育中察看到长久的ERK激活(图4d)。添加IIH6C4(一种针对Dag1-Agrin联合位点的阻断抗体)低落了Agrin诱导的ERK激活(图4e)。别的,利用PD0325901(PD,MEK克制剂)或抗Dag1抗体(图4f,g)阻断Agrin诱导的p7   CM增殖。在P7培育的CMs中,Agrin诱导的肌节剖析(扩展数据图8d)与Agrin医治后*得到心肌肌钙卵白T表达的CMs数目增长2.5倍分歧(图4j)。Dag1可以与Dystrophin联合构成糖养分不良卵白复合物(Dystrophin-glycoprotein   complex,DGC)。为了研讨Agrin-DGC与信号分子Yap之间的联系,用抗Syntorphin抗体对免疫沉淀DGC卵白举行了实行,并对复合物和Yap举行了印迹。DGC组分的Co-IP证明Agrin和Yap都市与DGC联合(图4k-l)。颠末Agrin处置后,CMs中核Yap的百分比增长了3-4倍(图4m)。而且,Agrin在Verteporfin(Yap-TEAD转录活性克制剂)存在下未能诱导CM增殖(图4n)。这一后果表示了在Agrin诱导的CM增殖历程中Yap相干的信号机制。综上所述,生化剖析标明,Agrin经过Dag1与DGC联合并低落其波动性,随后招致肌原纤维剖析和卑鄙信号分子(包罗Yap和ERK)的激活。



图5 Agrin促进hiPSC-CMs增殖并削弱其成熟


       研讨Agrin可否促进人诱导的多无能细胞(hiPSC-CMs)在明胶涂层2D基质上的增殖。人或大鼠细胞活性周期与Agrin出现浓度依赖性干系(图5a,b)。为了探究Agrin能否能克制hiPSC-CMs的成熟历程,接纳3D贴片培育体系,剖析了Agrin对hiPSC-CMs增殖和布局和功效成熟的影响。永劫间给药处置(100   ng/ml,两周)可促进CMs周期活性增长2倍(图5c)。别的,Agrin处置的CMs体现出成熟耽误,次要体现为传导速率低落(图5d),一系列功效性和成熟性标志的表达明显低落(图5e,f)。综上所述,与对小鼠的研讨后果分歧,Agrin促进了hiPSC-CMs在二维和三维培育体系中的增殖并削弱其成熟。


总结

      

       文章展现了Agrin作为复活小鼠ECM的一个紧张构成局部,是复活小鼠心脏再生bukequeshao的身分。在体外,重组的Agrin剖析DGC,并经过Yap和ERK介导的信号途径,诱导促进小鼠和人类多功效干细胞重新分解出心肌细胞。经过单次皮下注射Agrin到小鼠体内,也可以促进心肌梗去世的成年小鼠的心脏再生。同时,Agrin也可以促进了hiPSC-CMs在二维和三维培育体系中的增殖并削弱其成熟。只管该模子中察看到的CMs增殖水平标明还会有其他的作用机制,但这项研讨后果得出ECM的身分可以促进心脏的修复,此中Agrin处置表现出作为一种绝对宁静无效的修复哺乳植物受损心脏的药物的潜力。Agrin的发明将有助于CMs再生生物医学进一步的研讨。


       在该研讨中,细胞成像技能在hiPSC-CMs的构造学剖析中起到了至关紧张的作用,一台可以敏捷对多孔位细胞样品举行疾速高通量测试的仪器可让研讨事情到达事半功倍的结果。



       来自英国Plexithermo的HCells高通量单细胞、器官功效丈量及纳米水凝胶3D培育体系:可针对单个细胞形状、细胞张缩力、张缩速率、张缩功率、离子浓度变革、细胞活动轨迹,偏向和频率,以及速率或间隔量化等举行批量丈量,到达每小时300个以上单细胞的数据收罗,真正完成高通量单细胞收罗。


       收罗数据包罗多种单细胞力学目标:测细胞紧缩的速率和细胞力度、细胞巨细、面积、真正发生的功率,紧缩时的角度x轴y轴,发生的速率差和力差等。此体系的全主动设计,测试一轮后,可以定位回到统一个细胞反复丈量细胞的形态大概差别的处置。可以临时培育后,差别工夫对统一个细胞举行测试。丈量工具可以是贴壁细胞,如成年大鼠,成年小鼠,人源干细胞。高通量单细胞功效检测体系可以从细胞微观程度到构造微观程度评价林林总总[lín lín zǒng zǒng]的活动范畴、细胞活动轨迹、单个细胞力、硬度及离子浓度,如一个孔内一个小时测300个以上单细胞的紧缩和离子浓度疾速变革。

1、心肌细胞

接纳超速成像纳米水凝胶技能。包管药物肯定浓度程度下批量测心肌细胞的力学目标和离子浓度变革。测细胞紧缩的速率和细胞力度、细胞巨细、面积、真正发生的功率,紧缩时的角度x轴y轴,发生的速率差和力差等,而且可以模仿器官硬度。经过轨迹剖析选择跟踪地区和活动偏向。软件对迁徙单位的速率或间隔举行量化。可以剖析细胞活动的频率。细胞跟踪检测轨迹并提供定量数据跟踪功效还可以剖析面积、周长和圆度等参数,使软件可以跟踪外形变革,比方体外心肌细胞。

2、细胞迁徙和精子活动轨迹

跟踪函数检测细胞轨迹,并可以盘算定量数据,比方:作为轨迹(xy图表),间隔和速率。这使得体系具有检测和丈量功效,比方细胞迁徙和精子活动的轨迹。

3、静态跟踪可以剖析细胞增殖的变革,如菌落构成。

4、人iPS细胞衍生神经细胞的细胞生机测定

可以丈量神经元的活动。神经元活动的功率谱密度(PSD)可用于正确展望细胞殒命。PSD表现一个单位在频域中的活动强度。神经元培育的PSD比传统的生活才能丈量更准确地展望细胞殒命。

5、核跟踪特性可用于剖析癌细胞迁徙。

丈量工具:癌细胞、斑马鱼、精子、菌落、贴壁细胞(如:急性分散的成年小鼠细胞,乳鼠细胞、成年大鼠的心肌细胞、骨骼肌细胞、


参考文献:

Elad  Bassat, Yara EidMutlak, Alex Genzelinakh et al. The extracellular  matrix protein Agrin promotesheart regeneration in mice. Nature,  Published online 05 June 2017,doi:10.1038/nature22978


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