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    另辟蹊径:使用磁性纳米颗粒研讨iPSC心肌细胞3D球功效反响

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           多无能细胞(iPSC)经诱导可分解为心肌细胞(CM),从而发生民气肌的体外细胞模子即iPSC-CM。惯例2D培育的iPSC-CM表型通常不可熟。3D培育可进步iPSC-CM的表型成熟度,但通常操纵历程庞大,对设置装备摆设要求高,细胞产量小,研讨服从低。来自英国的研讨职员Matthew  P.  Burnham等经过添加磁性金-铁氧化物纳米粒可将磁性细胞球准确定位在记载电极上,并基于此办法研讨了共培育、胞外缓冲液身分、电起搏等要素对iPSC-CM的影响。以“A  Scalable Approach RevealsFunctional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids"为题宣布在SLAS Discovery上。


    研讨配景

           成年心肌在细胞层面次要包罗表型成熟的心肌细胞(CM)以及紧邻的心肌成纤维细胞。诱导多无能细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CM)为创建成民气肌细胞体外模子奠基了严重研讨底子。但该模子中的iPSC-CM细胞通常表型不可熟,存在具有自觉性qiboqi活性但搏动力度不敷,肌浆网(SR)钙(Ca2+)调治发育不*和肌膜离子通道表达不敷等缺陷。


           少量研讨标明在2D单层细胞培育条件下,iPSC-CM体表面型成熟度会遭到限定。而经过模仿种种心理条件如:3D矩阵和布局化支架、与非肌细胞支持细胞共培育、在弹性下层上的电起搏紧缩举动和机器调治、以及得当使用动力等均能明显进步iPSC-CM的表型成熟度。对3D   iPSC-CM功效和布局研讨办法许多,如iPSC-CM与非肌细胞支持细胞或细胞外基质卵白一同构成条状或环状,用光学方法追踪其紧缩性;经过在低粘附力外表或在悬滴中培育,iPSC-CM细胞可以自我组装构成3D布局,与视频显微术相联合也可检测其紧缩性;另有基于染料或光遗传的陈诉分子、微电极、多电极阵列或力传感器等办法来研讨3D  iPSC-CM的布局。但这些办法操纵历程庞大,对设置装备摆设要求高,服从极低,招致iPSC-CM产量偏低。


           因而想要举行更高效的iPSC-CM举行研讨,ag真人必要新办法。在低粘附力外表或水凝胶上构成的球状体/微构造是zuijiandan的获取iPSC-CM   3D布局的办法,但由此发生的球状布局处于自在漂泊形态,跳动活泼难以操纵,也难以牢靠检测。本文研讨职员经过将iPSC-CM与非肌细胞支持细胞和磁性金-铁氧化物纳米颗粒组装在一同构成unique共培育细胞球,并使所得的共培育细胞球带有磁性,可以被钕磁铁阵列定向和定位,从而将细胞球准确定位到2D iPSC-CM单分子层功效丈量的96孔传感板的感到电极上(CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH),经过记载紧缩力(阻抗)和细胞外场电位(EFP)检测细胞球心理目标。这是shouci以整板情势举行3D  iPSC-CM功效检测,同时联合96孔液体处置平台和声学分派软件,完成了高通量操纵。为研讨3D  iPSC-CM模子能否可以使用于成年心肌的更多心理学研讨,研讨职员还探求了成纤维细胞共培育(人原代培育的成纤维细胞和小鼠成纤维细胞系)、细胞外缓冲液构成和电起搏等要素的影响,证明该办法具有高效、可扩展性。


    后果

           为构建3D iPSC-CM细胞球模子,研讨职员向iPSC-CM和成纤维细胞共培育系统中参加金-铁氧化物纳米粒子,构成的磁性细胞球可被磁性阵列吸引并定位到感到电极上,检测率可达95%以上,且定位附着后的细胞球仍然可以维持精良的3D布局。



    图1. iPSC-CM共培育球形团簇的自组装及平板阵列的制备。(a)事情流程表示图,将共培育细胞在超低附着拆卸板中与铁-金纳米粒子一同组装成共培育细胞球,并利用与电极地位对齐的定制磁铁阵列将球体堆积到记载电极上,然后将其转移到传感器板上(CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH)。(b)iPSC-CM细胞在接种后4天内(第1-4天)以iPSC-CM独自或与成纤维细胞(fb)共培育情势组装到传感器板中。(c)钕磁铁阵列表示图(尺寸与传感器板中12×8电极阵各位置相反)。(d)  白腊切片HE染色标明金-铁氧化物纳米粒子进入球体(白色箭头),且球中心无坏去世。(e)  iPSC-CM球体附着到包被过的传感板电极4天后,举行中性红染色,发明3D布局坚持精良,并无2D单层细胞呈现。


           研讨职员对iPSC-CM   3D磁性细胞球模子举行了多项成熟度检测。经过传感器阻抗检测,发明参加金-铁氧化物纳米颗粒并不会改动细胞球的搏动特征,培育2天的细胞球搏动波动,搏动率为0.8±0.04Hz或49±2.4  bpm,幅度<5 ohm。400 nM异丙肾上腺素(L型Ca2+通道克制剂)处置后搏动频率进步,1μM维拉帕米(β-肾上腺素受体冲动剂)处置后搏动中止,与已知的药理学作用分歧(图2,表1)。在给药方面,研讨职员基于96孔液体处置平台(CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH)构建了一种高效配液给药办法,从培育记载板中吸出一局部温热的培育基,将其与DMSO储藏溶液疾速混淆,然后再次分派回培育记载板。该办法操纵复杂,用时短,可做到同时给药且浓度均一,极大地制止了人工操纵带来的种种影响,且给药时期记载板中温度变革在0.5℃范畴内。



    图2   经过阻抗感到检测iPSC-CM球的紧缩参数。(a)单个球紧缩和纪律搏动时的10s阻抗曲线向下偏转。(b)搏动特性在较永劫间内坚持波动。(c)蓝色曲线:400  nM异丙肾上腺素;玄色曲线:1  μM维拉帕米;灰色曲线:比较。(d)c图的均匀数据。(e)利用主动液体操纵举行累计添加维拉帕米,发生的浓度-呼应数据,n=9次反复。研讨职员探求了成纤维细胞共培育对iPSC-CM细胞球的影响。发明与小鼠和人成纤维细胞共培育,iPSC-CM细胞球搏动幅度辨别增长约15倍和6倍(图3a)。代表搏动偏转的矢量幅度增长了10倍以上(图3b)成纤维细胞接种比率也影响搏动率。iPSC-CM细胞球的搏动幅度随人成纤维细胞接种比例的增长而增长,但其搏动幅度随小鼠成纤维细胞的接种比例增长而低落(图3c和d,表1)。但是在差别的工夫点,差别成纤维细胞的收获比例都市让iPSC-CM细胞球发生激烈的紧缩,标明其紧缩力对成纤维细胞自己的存在更为敏感,而不是准确的成纤维细胞接种比率。



    图3  与成纤维细胞共培育可以明显调治iPSC-CM的固有紧缩举动。(a)阻抗记载表现搏动幅度,iPSC-CM球(CM  only),小鼠胚胎成纤维细胞共培育球(CM-Fb),原代人成纤维细胞共培育球(CM-hCFb)。(b)光学办法检测组装板中的搏动特征,发明成纤维细胞共培育对iPSC-CM搏动幅度有明显影响,(i,只要iPSC-CM;  ii, MEF共培育)。(c和d)增长人(i或空心正方形)或小鼠(ii或实心正方形)成纤维细胞比例对阻抗传感搏动幅度和速率的影响。



    CM,iPSC-CM细胞球;CM_Nano,含金-铁氧化物纳米颗粒的细胞球;CM_Fb_Nano,含金-铁氧化物纳米颗粒并与成纤维细胞共培育的细胞球。搏动特征以阻抗情势量化。


    增加肌膜Ca2+内流的电起搏展现了肌力反响

           正肌力药如异丙肾上腺素,通常惹起iPSC-CM共培育球体呈现变时性反响而不是变力性反响(图2a),大概反应了与肌膜相比,iPSC-CM共培育球体的肌浆网Ca2+处置才能绝对欠兴旺。经过调解台氏液中Ca2+浓度增加肌膜Ca2+内流,联合电起搏以控制搏动速率。在这些条件下,100 nM异丙肾上腺素使iPSC-CM共培育球体搏动幅度增约莫两倍(图4a)。细胞外Ca2+浓度滴定,从1.5 mM开端,标明在0.9 mM或更低的浓度时具有浓度依赖性,在0.6 mM更分明(图4b)。本研讨未反省起搏的临时效应,但在0.9 mM Ca2+没有异丙肾上腺素安慰的状况下,起搏20s后的zuihouyi次搏动较diyi次搏动幅度曾经增长了1.24±0.8倍。在比较培育基或1.5mM 台氏液条件下,这种作用是不存在的(图4c),这证明了该机制与肌膜Ca2+内流增加有关。只管iPSC-CM共培育球体的应力-应变干系尚未量化,但鉴于共培育球体弹性系数(刚度)在急性实行时期坚持稳定,iPSC-CM共培育球体中的力发生(应力)可以由搏动幅度(应变)的绝对变革来表现。与异丙肾上腺素类似,digaoxin(Na+/K+ATPase克制剂)和xidinafei(5型磷酸二酯酶克制剂)在底子条件下均未惹起搏动幅度反响的增长。但是,在电起搏大概Ca2+浓度低落的条件下,digaoxin惹起分明的肌力反响(搏动幅度增长1.9±0.5倍),而xidinafei则无正性肌力作用(0.8±0.1倍)。这种状况大概由于digaoxin是一种非β-肾上腺素能机制的正性变力因子,而xidinafei在离体心肌细胞中是经过HCN(超极化激活环核苷酸门控通道)通道被激活起作用的。



    图4 肌力反响受胞外Ca2+浓度和电起搏调治。(a)在含0.6 mM Ca2+的台式液和1 Hz电起搏条件下,100 nM异丙肾上腺素可以使搏动幅度(肌力反响)增长。异丙肾上腺素添加前(实线)/后(虚线)。尺度化之后搏动曲线宽度变小。(b)在划一搏动条件下对异丙肾上腺素安慰发生的肌力反响要求胞外Ca2+程度低于1.2 mM。(c)含0.9 mM Ca2+的台式液且无异丙肾上腺素到场条件下,搏动20s之后的振幅(实线)较diyi次搏的动振幅(虚线)有所增长,但在比较组或1.5 mMCa2+台氏液组并没有这种征象。(d)正性肌力药物digaoxin(1μM)能够惹起与异丙肾上腺素相似的动摇幅度增长,但磷酸二酯酶克制剂xidinafei(10 μM)不会发生相似结果。


    自主搏动的3D球体中细胞外电位(extracellularfield potentials,EFPs)的检测

          EFP可以经过记载自主搏动的iPSC-CM共培育球体来检测(图5a)。利用维拉帕米(100 nM)和L型钙通道激活剂BayK-8644(1 µM)处置,辨别招致EFP分明延长和延伸(图5b,c),与已知的后果分歧。值得留意的是,Bay K-8644处置后呈现了分明的后去极化耽误(delayedafter-depolarizations,DADs)(图5c),代表肌浆网Ca2+含量超载,招致Ca2+开释和外向电流的瞬时激活。自主搏动的iPSC-CM共培育球体被检测到的EFP信号不如阻抗信号强(约为阻抗乐成率的50%)。EFP记载历程中自动紧缩力和球体活动的影响尚不明白,但场电位继续工夫(fieldpotential  duration,  FPD)参数的药理调治已明白创建。参加金-铁氧化物纳米粒子对EFP没有分明影响。底子条件下,在接种后第7天到第20天之间,共从12个传感器板中的四个独立批次中的1037个iPSC-CM共培育球体举行定量了EFP和阻抗节奏检测(图5d)。iPSC-CM共培育球体的搏动率随培育工夫低落,而且12天后FPD数据的疏散性也增长。一切传感器板的搏动速率和FPD的均匀变异率(%CV)值辨别为8%和10%。



    图5自主搏动的iPSC-CM共培育球的细胞外电位EFP检测。(a)比较。(b)100  nM维拉帕米处置。(c)1 μM  Bay-K8644处置。FPD长度以及DAD变革都很分明。数据泉源于接种后7-20天12个独立记载板中的1037个成纤维细胞共培育球,检测EFP和阻抗,标明基线FPD和搏动率都比力明显。


    iPSC-CM和共培育球体的复极机制差别

           与独自培育的iPSC-CM相比,与小鼠成纤维细胞(MEF)共培育会低落共培育球体的搏动率并稍微增长场电位继续工夫(fieldpotential  duration, FPD)(BR:41.3±4.7 bpm vs 52.9±6.4 bpm; FPD:0.53±0.06 s vs  0.50±0.07 s)。在短工夫内(3-10分钟)利用的空载体,30nM E-4031(hERG通道克制剂)或100 µM BaCl2(几个K+通道的克制剂,包罗Kir2.1)处置发明,共培育球体对E-4031的反响具偶然间依赖性且易形成心律变态。在产生心律变态之前,   E-4031短时(3分钟)辨别处置独自培育的iPSC-CM和共培育球体发生的效应相似,而且FPD降低(图6),与其他研讨分歧。在独自培育的iPSC-CM中,FPD与搏动速率之间的线性干系坚持稳定,这标明与速率校正后的FPD的偏向与心律变态的产生相符合。在共培育球体中,FPD分明偏离了节律丢失前的基线干系。这与参加BaCl2(3分钟)的反响构成光显比拟,BaCl2反响在MEF共培育球体中经过增长BR和FPD尺寸而分明差别(图6)。共培育球状体中的BaCl2是增长搏动节律的unique条件。别的,BaCl2的这些作用在原代培育的民气脏成纤维细胞共培育球体(SUPL)中也很分明。



    图6 iPSC-CM独自培育和与成纤维细胞共培育的复极化机制。辨别用30nM E-4301(绿色)、100 μM BaCl2(白色)、DMSO比较(蓝色)处置后,独自iPSC-CM球(iPSC-CM,实心)和共培育球(CM+Fb,空心)的FPD与搏动率比力。(a)均匀数据。(b) E-4301 散点图。(c)BaCl2散点图。BaCl2处置后仅有iPSC-CM独自培育细胞球搏动率明显降低,标明差别细胞球中的离子通道表达大概有差别。


    总结

           本研讨剖析了1000多个iPSC-CM共培育球体,完成无标签丈量其紧缩性和EFP。联合利用声学丈量和主动处置平台(CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH),开辟出了高效配药办法。这些办法实用于对iPSC-CM的3D共培育表型剖析,可以完成高通量处置庞大状况下的iPSC-CM成熟度相干的特性剖析。为验证该办法的无效性和可扩展性,研讨职员证明白iPSC-CM与差别泉源的成纤维细胞的球状共培育在某些条件下将其搏动幅度进步了一个数目级。经过低落肌膜Ca2+浓度和电起搏来控制搏动频率,可以使iPSC-CM通常不存在的正性肌力反响呈现,而且在差别机制的正性肌力药物作用下也可以看到相反结果。最初,与共培育细胞球体相比,iPSC-CM举措电位复极化显然触及到差别的离子通道, 包罗差别于E-4031反响的BaCl2敏感局部。这些后果明白标明,iPSC-CM在表型上对3D共培育的球体情况有典范的反响,而且该体系提供了其他优化处置手腕(比方细胞范例、临时光遗传学或电起搏、细胞外基质等)。这种新鲜而且复杂的研讨办法可以掩盖iPSC-CM心理学的多个成熟度相干的检测剖析,并促进了球体共培育模子的进一步开辟,该办法可使用于疾病建模,iPSC分解,心血管zhiliao范畴或药物宁静性验证等范畴。


    参考文献:

    A  Scalable ApproachReveals Functional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids. SLAS Discovery, DOI:10.1177/2472555220975332.


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