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Science:构造多少学决议器官培育中乳腺的分支形状产生位点

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       包罗乳腺在内的很多器官的树状布局是经过分支形状产生(branching morphogenesis)历程构成的。分支形状产生是一个原有上皮细胞产生分支并侵入的反复历程。为探求是什么要素决议着分支形状产生肇始的位点,美国劳伦斯伯克利国度实行室的研讨职员Celeste M. Nelson等经过凝胶铸模的办法,利用小鼠乳腺上皮(EpH4)细胞构建了可控制初始多少形状的乳腺上皮小管3D模子,并联合算法对分支状况举行量化,发明小管的多少形状可以决议分支肇始的地位。研讨进一步证明了分支肇始于自排泄型克制形状产生子,如转化生长因子β(transforming growthfactor–β, TGFβ)部分浓度最小的部位。而构造的多少形状又可以影响部分细胞微情况,从而控制形状产生。该效果以“Tissue GeometryDetermines Sites of Mammary Branching Morphogenesis in Organotypic Cultures"为题宣布于Science杂志。


研讨配景

       乳腺上皮小管雏形在个别出生时就已存在,但在芳华期会忽然呈现分叉和侧向分支,由此从乳腺上皮小管雏形变化为成年雌性发育*的乳腺导管树。该历程中的分支形状产生遭到很多要素的调治,包罗生长因子(growth factors)、细胞外基质分子(extracellular matrix)、卵白酶(proteases)和形状产生子(morphogens)。这些因子必需在产生分支的构造中整兼并综互助用,以确定分支肇始的地位,确定一组上皮细胞能否要构成分支或分叉。现在在肺、肾和唾液腺等很多器官中针对这一历程的研讨,曾经有许多技能办法,但关于分支肇始的空间地位是怎样决议的,现在还无法举行准确的量化剖析。思索到乳腺导管网络是从已有的上皮小管分付出来,研讨职员假定上皮小管内细胞的地位大概对肇始分支位点有肯定的决议作用,并对此举行实行。后果发明构造的形状和情况,包罗多细胞小管的多少外形,以及它们与邻近小管的靠近水平,都能影响分支产生的地位。


后果与讨论

       研讨职员开辟了一种三维(3D)微模子,行将功效正常的小鼠乳腺上皮(EpH4)细胞包埋在特定外形的胶原凝胶空腔中,构建出特定多少形状的乳腺上皮小管,进而经过控制小管的初始多少形状来模仿乳腺雏形,并量化它们产生分支的地位。上述胶原凝胶空腔是利用未聚合的胶原I(collagen I)和弹性“印章"(stamp)铸模发生的(图1A)。包埋于凝胶空腔中的上皮细胞可以贴合空腔巨细和外形构成中空小管(图1,B和C)。为量化分支状况并从统计学上表现出巨细和地位,研讨职员对细胞核举行染色,并将多个荧光图像堆叠以表现出小管内和从小管分支的细胞的均匀空间散布(图1D),并将图像图像堆叠制身分布频率图(图1E)。构建的小管模子构成准确极化的双层小管,即由肌上皮细胞和基底膜困绕着一层内腔上皮细胞(图1H)。


       添加表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)(图1F)小管举行分支形状产生。诱导后24小时内,发明有多细胞分支延伸到四周的胶原基质中,且这些分支只从小管末了开端,并不从正面开端(图1,F和G)。这一形式与体内乳腺顶芽的二分支相似。


       细胞必需产生变形并侵入四周的构造以启动分支产生。已知乳腺和肾脏3D培育历程中,上皮细胞在侵入四周细胞外基质时,分支jianduan会履历长久的上皮-间质变化(epithelial-tomesenchymaltransition, EMT),该历程会修饰细胞表达的粘附分子,从而使其具有迁徙和侵袭性举动。由于凝胶模子体系可以较为确定地(96-99%)展望分支的地位。于是研讨职员对迁徙相干的波形卵白基因启动子调控绿色荧光卵白(GFP)的表达举行及时原位剖析,发明在随后会产生分支的地位的细胞中,这种侵袭性间充质表型会被特异性激活(图1,J和K)。同时研讨职员发明阻断乳腺分支形状产生侵袭历程所需的基质金属卵白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)和间充质泉源的形状产生子如表皮形状产生素(epimorphin)的活性,会阻断小管分支,但并不会制止波形卵白基因启动子的激活(图S2)。这些数据标明在分支延伸之前,侵袭性表型被限定在肯定空间内,细胞依据它们在小管内的地位决议能否举行分支。



图1。构建的乳腺上皮小管的构成的分支的特性。A为构建3D小管模子的表示图。B为诱导分支前小管的相位衬度图像。C为诱导分支前小管细胞actin(绿色)和细胞核(蓝色)染色的共聚焦图像。D为将50张小管细胞核的图像举行堆叠。E为堆叠发生的诱导分支前的细胞散布频率图。F和G辨别为参加EGF诱导分支24小时后,小管的相位衬度图和频率图。H为小管中上皮角卵白-8(绿色)、肌上皮角卵白-14(白色)和细胞核(蓝色)举行染色,失掉的共聚焦图像;插图Z型截面。I为添加EGF24小时后小管的散布频率图。J为添加EGF8小时后,波形卵白基因启动子-GFP(绿色)和细胞核(蓝色)的荧光图像。K为添加EGF8小时后,波形卵白基因启动子-GFP的表达频率图。比例尺50μm


       经过反省差别多少形状小管的形状产生历程,研讨职员发明增长小管长度会使分支增长,但细胞仍旧只从末了举行分支。弯曲的小管优先从曲线的凸面分支(图2A)。分叉小管和树形布局中也察看到不合错误称分支(图2,B和C),优先从远端地位分支。且分支必要细胞增殖,但并不是于增殖或生长因子受体的部分加强信号而招致分支产生。


       有研讨发明,分支形状产生的地位大概由临近间充质构造排泄的安慰性形状产生子有关,可作为上皮分支的化学诱惑剂。但远端开释诱导信号如外源添加EGF,又大概被上皮细胞部分开释的克制信号均衡失。因而在小管上皮细胞自排泄克制因子部分浓度最小或阈值浓度以下的地位,就大概是分支产生的地位。


       实行中构建的小管内的上皮细胞在没有相邻间充质细胞的状况下体现出形式化举动,因而必要验证这种假定。研讨职员整理了种种形状下克制因子的浓度,发明在波动形态下每个小管四周都发明了克制因子构成的浓度梯度(图2,D、E、F),并且在诱导分支的地位,克制因子的浓度zuidi。



图2。分支地位由小管的多少形状决议,并与排泄型分散克制因子的浓度散布相干。A和B 辨别为诱导分支24小时后,弯曲小管和分叉小管的散布频率图。C为分形树的actin(白色)和细胞核(绿色)免疫荧光染色图。箭头所示为分支位点。D、E和F辨别为弯曲小管、分叉小管和分形树的可分散克制因子的浓度散布。实行验证展望的克制因子部分浓度zuidi的地位便是诱导产生分支的地位。比例尺50μm。


       研讨职员还探求了增长克制因子的部分浓度能否足以阻断小管末了的分支。经过减小小管之间的间隔(图3,A和B)发明,分支产生在远真个小管末了,相临近的末了并不分支(图3,C和D)。在约75μm间隔内,小管分支都市遭到克制。已知在小鼠乳腺中也发明了相似的导管间距。因而构造的初始多少形状变革也会经过影响克制因子的浓度散布来改动分支产生的地位。



图3。分支的地位可以经过克制因子浓度散布来展望。A和B辨别为互相垂直宁静行方位下,小管四周分散性克制因子浓度散布。C和D为诱导分支24小时后的分支频率图,标明高浓度克制因子的地区,分支遭到克制。比例尺50μm。


       已知很多卵白会克制体内乳腺分支的形状产生,包罗转化生长因子β(TGFβ),它经过I型Ⅱ型受体构成的四聚体复合物收回信号。本研讨中构建的小管也可以表达TGFβ及其受体,免疫荧光染色表现TGFβ1的浓度梯度与ag真人的数值展望相干(图4A)。活性TGFβ1过表达会*克制分支(图4,B和C)。为确定TGFβ能否在该体系中作为内源性克制剂,研讨职员利用三种办法阻断其信号传导:抗TGFβ1功效阻断抗体处置;用TGFβ Ⅰ型受体激酶活性制剂处置;显性阴性TGFβ Ⅱ型受体过表达。后果发明一切阻断处置都市使整个小管上呈现匀称的分支征象(图4,D和E,以及图S6)。



图4。克制活性局部由自排泄的TGFβ介导。A为小管模子的共聚焦切片,对TGFβ1举行染色,图示沿小管(白色)和阔别小管(绿色),绝对像素强度和间隔的函数。蓝色曲线为展望曲线。B和C辨别为诱导分支24小时后,比较小管和过表达TGFβ1小管的散布频率图,证明TGFβ1可以克制分支。D和E标明阻断内源性TGFβ1信号会扰乱分支的地位控制,辨别为载体比较细胞和过表达显性负型TGFβ受体Ⅱ型(HA-DNTβRⅡ)的细胞,对应小管诱导分支24小时后的散布频率图。比例尺50μm。


全文总结

       本文用一种复杂离系统统,使构建的乳腺上皮小管也能体现出庞大的分支和侧向分支举动,因而在体内,导管的多少形状也会影响形状产生历程。该机制大概协助ag真人了解乳腺在发育历程中是怎样完成开放布局的。已知分支形状产生的地位至多有一局部是由乳腺和其他分支器官所排泄的克制性形状产生子如TGFβ的部分浓度决议。思索到TGFβ以非活性的埋伏情势排泄,且研讨发明野生型过量表达的TGFβ1并不会影响分支,因而大概还必要其他信号到场决议分支地位的克制活性的浓度散布。已知基质金属卵白酶和基质金属卵白酶的构造克制剂(TIMPs)会影响分支。思索到细胞间的张力可以改动细胞对形状产生子的反响或形状产生子自己的活性,因而发扬作用大概是化学信号也大概是机器信号。

 

       好久曩昔就有很多实际迷信家提出过假定,构造发育形式大概与安慰型和克制型形状产生子浓度梯度之间的均衡机制有关。本研讨利用的凝胶模子体系可以完成间接定量测试这些要素在相干发育情况中的地位整合状况,并可以扩展用于研讨控制任何分支器官体系形状产生的机制。


参考文献:

Nelson,  Celeste M , VanDuijn, et al. Tissue Geometry Determines Sites of  Mammary Branching Morphogenesis in Organotypic CUltures.[J]. Science,  2006.


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