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前沿热门:心肌细胞舒张功效停滞模子的单细胞功效检测

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      心血管疾病的机制研讨不停是生物医学研讨的重点范畴之一。比年来,随着新技能的不停涌现人们对心血管疾病产生与开展的机制了解不停深化并极大地改进了临床诊疗程度。而关于单心肌细胞愉快紧缩偶联机制以及病理心理形态下心肌紧缩舒张功效停滞的研讨为ag真人在细胞学层面了解心肌疾病提供了紧张的底子。近期,斯坦福大学的研讨者在《European Heart Journal》杂志宣布了题为Modelling diastolicdysfunction in induced pluripotent stemcell-derived cardiomyocytes fromhypertrophic cardiomyopathy patients的研讨论文,接纳了新的视角去探究心脏疾病中心肌细胞的功效与疾病之间的联系。


       舒张功效停滞(Diastolic dysfunction,DD)是肥厚型心肌病(HCM)患者的明显临床特性也是招致肥厚型心肌病患者殒命的次要缘故原由,体现为舒张期心室舒张迟缓或不*。HCM患者产生心肌舒张功效停滞的详细细胞学机制尚不*明白,严峻限定了临床医治结果。


      在以往的研讨中,人们创建了多种HCM的植物模子(从啮齿植物到大型植物)和疾病诱导办法。但,由于种属差别,植物模子的研讨后果间隔临床使用相去较远,急需人源化的研讨手腕。比年来,接纳肥厚型心肌病患者泉源的多无能细胞源性心肌细胞(iPSC-CM)在研讨舒张功效停滞在肥厚型心肌病中的潜伏机制以及新药研发方面具有宏大潜力。


       在该研讨中,接纳了Plexithermo HCell系列单心肌细胞功效检测体系。起首经过外周血单核细胞重编程和诱导分解乐成创建了舒张功效停滞的iPSC-CM细胞模子,该模子携带了家属性HCM中zuichang见的三种基因渐变(即:肌球卵白重链7, MYH7、肌球卵白联合卵白C3,MYBPC3和心肌肌钙卵白T2 ,TNNT2)。颠末细胞判定落伍行舒张功效剖析。与正常比较组iPSC-CM细胞相比,HCM iPSC-CM 组心肌细胞舒张期肌节长度分明延长;呈现maximum舒张速率低落和舒张工夫延伸而紧缩速率未见变革。



图1:肥厚型心肌病患者泉源的多功效干细胞衍生分解心肌细胞呈现舒张功效停滞。(A)iPSC-CMs的免疫荧光染色微阵列图像,表现分列的肌节布局。(B和C)接纳过表达GFP-actin荧灯光显示示iPSC-CMs肌节,并经过活细胞共聚焦扫描取得肌节紧缩舒张图像。(D-G)与正常比较iPSC-CMs组相比,HCM-iPSC-CM组呈现舒张期肌节长度延长(D)、maximum肌节舒张长度(E)稳定、maximum舒张速率(F)减慢、90%舒张工夫(G)延伸。


       细胞内钙稳态在心肌细胞愉快紧缩偶联中发扬至关紧张的作用,该研讨进一步经过Fura-2 AM荧光成像办法发明,与正常比较组iPSC-CM相比,HCM-iPSC-CM在舒张期心肌细胞内[Ca2+] i程度明显降低和呈现Ca2+失稳态,且在β-肾上腺素安慰下Ca2+失衡进一步加剧。同步察看心肌细胞内钙瞬变和心肌紧缩力后果发明,HCM-iPSC-CM的肌丝具有更强Ca2+敏理性(以dF/Δ[Ca2+]i权衡)。而且,经过CRISPR  / Cas9对正常心肌细胞构建TNNT2  R92W渐变大概对HCM-iPSC-CM的渐变举行修正,均证明了肥厚性心肌病的基因渐变可招致心肌呈现舒张期钙超载,钙回摄减慢,肌丝钙敏理性加强,终极侵害HCM-iPSC-CM的舒张功效。



图2:Fura-2AM荧光指示检测HCM-iPSC-CMs舒张期细胞内Ca2+。与Ctrl-iPSC-CMs相比, HCM-iPSC-CMs舒张期细胞内Ca2+降低(B),Ca2+回摄明显延伸(C)。接纳kafeiyin诱发钙瞬变发明HCM-iPSC-CMs的SR开释更多的Ca2+,钙瞬变衰减工夫延伸。


图3:细胞功效成像表现HCM-iPSC-CMs舒张功效停滞。同时记载心肌细胞钙瞬变和细胞紧缩应力,与Ctrl-iPSC-CMs相比,HCM-iPSC-CMs的钙瞬变幅值未产生明显变革,但钙瞬变速率和肌丝钙敏理性均加强。


图4:β-肾上腺素处置减轻HCM-iPSC-CMs舒张功效停滞。ISO处置进一步进步了HCM-iPSC-CMs中舒张期细胞内Ca2+浓度,明显延伸了钙瞬变衰减工夫,减轻细胞内Ca2+非常失衡。固然ISO处置对Ctrl-iPSC-CMs和HCM-iPSC-CMs的紧缩节律均有进步,但HCM-iPSC-CMs组中呈现更为严峻的舒张期肌节长度延长;舒张速率低落和舒张工夫延伸。


       上述后果标明了Ca2+稳态对HCM-iPSC-CM的舒张功效的紧张作用,该研讨进而接纳Ca2+阻断剂(10–200  nM verapamil 和 10–500 nM diltiazem)和早期Na+通道阻断剂(1–10 µM ranolazine 和  200nM to 1 µM  eleclazine)处置可明显改进HCM-iPSC-CM的心肌舒张功效,体现为延长舒张期肌节长度,加速舒张速率,增加舒张工夫;并明显促进了HCM-iPSC-CM的存活。而且发明,与比较组iPSC-CM相比,HCM   iPSC-CM中L型Ca2+通道(LTCC)和瞬时受体电位阳离子通道(TRPC1,3)的表达明显增长,招致TRPC依赖的Ca2+内流加强。这大概是招致HCM-iPSC-CM舒张期钙超载的紧张缘故原由。


图5:Ca2+阻断剂和早期Na+通道阻断剂可改进HCM-iPSC-CMs钙稳态和舒张功效。Ca2+阻断剂和早期Na+通道阻断剂处置可低落HCM-iPSC-CMs舒张期细胞内Ca2+并延长钙瞬变;增长舒张期肌节长度和舒张速率,延长舒张工夫。


图6:规复钙稳态可明显进步永劫程β-肾上腺素安慰下的HCM-iPSC-CMs存活率。对HCM-iPSC-CMs中钙稳态调控的要害因子的表达程度举行剖析发明Cav1.2,MYH7,   NPPA和NPPB表达增长,MYH6,Casq2和Cav3表达低落。CaMKIId自磷酸化(pThr286)较Ctrl-iPSC-CMs分明加强。经过Ca2+阻断剂和早期Na+通道阻断剂处置可缓解上述非常,而且无效缓解永劫程β-肾上腺素安慰招致的HCM-iPSC-CMs钙超载和细胞殒命,无效进步HCM-iPSC-CMs的存活率。


图7:接纳患者泉源的iPSC-CM模子展现肥厚型心肌病舒张功效停滞的细胞机制表示图。


       该研讨创建了一个新鲜的平台来研讨基于HCM患者的iPSC-CM的舒张功效停滞的相干细胞学机制:shouci在单细胞程度上证明白舒张期Ca2+超载和肌丝Ca2+敏理性增长均与HCM   iPSC-CM的舒张功效停滞亲密相干。别的,该研讨还标明经过常用药物医治(比方Ca2+通道阻断剂和Na+通道停滞剂)可以改进HCM-iPSC-CMs的舒张功效。该研讨标明,基于HCM患者的  iPSC-CM 模子的功效成像剖析和药物检测为心肌细胞病理心理学机制研讨和开展潜伏的HCM医治战略提供了新的研讨平台。


参考文献:

Haodi,  W. , Huaxiao, Y. , June-Wha, R. , Zhang, J. Z. , Keung, L. C. , & Karim, S. , et al. (0). Modelling diastolic dysfunction in induced  pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic  cardiomyopathy patients. European Heart Journal(45), 45.


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