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CELL:转录因子的协同作用网络对人类心脏的功效维持具有紧张意义

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研讨亮点:

1 体系性办法展现了GATA4在人类心脏发育和功效中的作用
2 杂合子GATA4错义渐变侵害心脏基因步伐
3 GATA4 G296S渐变毁坏了心脏加强子TBX5的基因组占用
4 PI3K信号通路是GATA4基因调控网络的要害关键

研讨配景


转录因子(TFs)之间的组合互相作用招致构造特异性基因表达,从而决议了细胞的特征并维持细胞内稳态平。TFs经过招募其他TFs、辅激活因子或辅克制因子来激活或克制基因转录。超等加强子(SEs),被中介复合物和TFs麋集占有的假定加强子簇,被以为是发育和疾病中细胞统一性的调治因子。SEs的失调大概招致人类胚胎产生发育停滞和产后疾病。发育畸形占人类出生率大于5%。此中,后天性心脏缺损所占比例maximum(0.8%),并且通常是由于发育性调治型心脏TFs单倍型不敷而招致的。在TFs中杂合渐变GATA4和TBX5会招致家属性后天性心脏发育不全,二者表型重叠;当过表达这两个基因时,两者免疫共定位。在零散的后天性心脏发育不全中,这两个基因存在渐变,且与心肌病相干。ag真人之前的研讨标明,GATA4在G296S位点的渐变会招致GATA4和TBX5在体外的互作才能受损。携带复合杂合子Gata4和Tbx5渐变的小鼠会产生房室距离缺损,为GATA4与TBX5二者之间的互作提供了遗传学证据。


只管Gata4和Tbx5对小鼠心脏产生至关紧张,但它们在人类心肌细胞(CMs)中配合调治的基因靶点或信号通路以及它们怎样调治人类心脏距离的构成尚不明白。与GATA4互相作用的TBX5或Nkx2.5*缺失,标明这些TFs在小鼠心脏分解中互相依赖调治相互的基因组占用。

研讨后果


转录因子中高度守旧残基的渐变大概会影响卵白与卵白或卵白间的互相作用,招致基因网络的失谐和人类疾病。本研讨利用患者源性诱导多无能细胞(iPS)细胞来分析GATA4在人类心脏发育和功效中的调治机制。研讨职员使用了来自于患者G296S渐变的、经过CRISPR-Cas9修正的(iWT)   以及正凡人的野生型(WT)成纤维细胞以非整合游离载体办法重编程取得三种iPS,在图案化水凝胶的作用下将iPS培育分解为心肌细胞CMs。在分解CMs历程中,对其举行转录组测序及剖析,对心肌细胞分解历程中的标记性基因表达状况,钙通量及显微镜下形状举行了检测和剖析。


研讨发明,杂合的GATA4  G296S渐变侵害了心脏基因步伐和sonic hedgehog  (SHH)信号通路的表达,同时上调了可变运气基因的表达,分外是内皮细胞谱系和与心脏分开相干的基因。在与心脏发育和肌肉紧缩相干的基因SE元件处,GATA4依赖的TBX5的召募被中缀,而在到场内皮分解的基因座染色质封闭失败。这项事情展现了一个要害心脏TF的单一错义渐变是怎样经过剂量依赖性调治TF复合物向加强因子的招募而招致疾病的,并展现了医治干涉的潜伏节点。



图1 G296S CMs心脏功效受损。(A)流式剖析泉源于WT和G296S分解而来的、乳酸纯化后的c替恩替+CMs   。(B)CMs的单细胞阵列的微图(上)和α-Actinin或F-actin的免疫染色(下)。(C)微观形式的紧缩丈量。WT和G296S单厘米对1  Hz起搏呼应的百分比(左图)。牵引力显微镜丈量力发生作为细胞活动的CMs对1Hz起搏呼应的函数(右图)。(D) WT和G296S  CMs的举措电位丈量。(E)微团簇上钙通量的丈量。(F)特定微构造的钙通量丈量。(G)α-Actinin染色察看单个赘瘤类CMs所占的百分比。(H)线粒体单厘米微形式染色强度(上图)。定量丈量细胞核破裂追踪器绝对于细胞面积的白色强度(下图)。(I)糖酵解功效丈量。



图2 GATA4 - TBX5 GRN表现关键会合于PI3K信号。(A)GATA4控制的GRN(B)按基因标记定名的前20个关键的子网络图(C)在PI3K信号被克制(圆形)或激活(三角形)后iWT(玄色)和G296S(白色)CMs发生的绝对变革(D)PI3K信号被克制(圆形)或激活(三角形)后,iWT(玄色)和G296S(白色)CMs的搏动率丈量(E)假定模子。上图,WT基因的心脏基因位点开放且容许G4T5与med1联合的SE元件联合,激活转录;G4T5和HDAC2克制非常内皮基因转录。下图,GATA4   G296S的转录和表观遗传后果。心脏基因座低落了开放染色质和TBX5与SE元素的联合,低落了转录;非常开放的染色质缺失了GATA4-HDAC2,但TBX5富集,同时ETS因子的基序招致内皮基因转录缄默失败,其他到场距离发育的位点未形貌。


研讨意义


本研讨标明,得当的心脏发育和功效必要MED1联合的h3k27ac标志SE元素的GATA4-TBX5的配合到场,以维持开放的染色质形态并激活心源性基因转录。杂合性GATA4错义渐变影响卵白质-卵白质互相作用,TBX5无法召募到SE元件与未能坚持开放的染色质形态以及心脏基因的转录低落有关。GATA4   G296S渐变容许TBX5和其他转录激活因子的错误定位,招致无法招募到HDAC2,并在内皮启动子上完成更关闭的染色质特性。后果招致内皮基因表达的非常激活和谱系改动。到场SHH信号吸收和心脏分散的基因失调为GATA4   G296S患者的三维距离缺损提供了分子底子。这些研讨展现了TF复合物怎样经过协同调控反式作用因子的全基因组定位来控制基因表达的激活和克制,以及当协异性被毁坏时疾病是怎样产生的。


这一研讨后果表明了一个启感人类心脏基因步伐的组合TF联合暗码子,并展现了经过错义渐变毁坏该暗码子怎样招致表观遗传和转录失谐和人类疾病。ATAC-seq剖析开放染色质特性和GATA4和TBX5联合位点的全基因组剖析提供了人类TF联合加强子的细致目次,并增补了稀缺心脏细胞范例的编码数据,同时使用这些数据判定了一个假定的G4T5辅克制子。综上所述,本研讨展现了一个组合的TF代码,这一代码确保了一个壮大的心脏基因步伐,分析了当经过搅扰该代码的TF协异性时人类疾病是怎样产生的,并提出了医治干涉的潜伏节点。


本实行中分外触及了一种细胞培育和丈量手腕


iPS-CMs细胞的体外培育
将细胞接种在聚丙烯酰胺水凝胶安装上,该安装具有基质凝胶微布局。由缩印手腕在水凝胶外表制备长宽比为7:1、面积为2000平方微米的矩形凹槽。这些特定的微布局具有肯定的刚度及外形,有利于模仿体内CMs的真实情况,可原位培育并剖析单个CMs。之后,可用牵引力显微镜盘算细胞附着在聚丙烯酰胺外表所发生的力。


单个CMs紧缩力丈量
在水凝胶中混入荧光微珠,利用Zeiss颠倒显微镜测试紧缩CMs的明场视频以及因细胞紧缩而挪动的绿色荧光微珠的视频。明场视频被用来盘算每个紧缩周期的细胞活动及均匀位移。荧光微珠视频则提交到牵引力显微镜算法来盘算紧缩力。


钙通量剖析,膜片钳测试
Fluo-4染色后接纳延时成像技能来丈量钙通量。选择自觉紧缩的微团簇的特定地区,用软件量化举措电位之间丈量到的钙瞬变表达绝对于基线荧光的峰值振幅。接纳全细胞膜片钳在单细胞程度丈量CMs的举措电位


作为实行前置内容,细胞培育与力学、钙通量测试在后续基因表达剖析事情中起到了要害性的作用。在该事情中利用的是英国PlexithermoHCells高通量单细胞、器官功效丈量及纳米水凝胶3D培育体系。



该体系可利用多种定制水凝胶耗材模仿细胞微情况,亦可以自行设计蚀刻水凝胶以满意差别的研讨需求,尤其实用于心肌细胞体外培育情况的构建。搭配unique的细胞追踪技能,可短工夫内丈量300个以上细胞的紧缩及离子浓度变革状况。搭配多孔位细胞培育板,完成真正的高通量细胞测试,每个孔位即可作为一组比较实行,差别孔位同时培育,同时丈量,极小节省工夫及耗材。


实用范畴:


1、心肌细胞
接纳超速成像纳米水凝胶技能,可wanmei模仿器官硬度。批量测心肌细胞的力学目标和离子浓度变革。包罗细胞紧缩速率和力度、紧缩功率,紧缩角度,速率差和力差等,


2、细胞迁徙和精子活动轨迹
跟踪检测细胞轨迹,并可盘算定量数据,如:活动轨迹,间隔和速率。


3、静态跟踪细胞增殖的状况,如菌落构成。


4、人iPS细胞衍生神经细胞的细胞生机测定:神经元活动的功率谱密度(PSD)可,用于正确展望细胞殒命。PSD表现一个单位在频域中的活动强度,可以更准确地展望细胞殒命。


5、核跟踪特性可用于剖析癌细胞迁徙


6、丈量工具:癌细胞、斑马鱼、精子、菌落、贴壁细胞(如:急性分散的成年小鼠细胞,乳鼠细胞、成年大鼠的心肌细胞、骨骼肌细胞等)。


参考文献:

Ang  Y S , Rivas R N , Ribeiro A J S , et al. Disease Model of GATA4  Mutation Reveals Transcription Factor Cooperativity in Human  Cardiogenesis[J]. Cell, 2016, 167(7):1734-1749.e22.


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